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多重PCR引物设计的免费软件：iCubate2.0
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页面上面给iCubate2.0开放平台上面的试剂（iC)做了一个定义：iC, 就是用多聚酶亲和指数（PPI, polymerase preference index)程序, arm-PCR (amplicon rescued multiplex PCR)原理设计出的，在iCubate技术平台上使用的多重PCR试剂。
页面下面有三个供选择的区域：iC 建筑师，iC 网店，和iC 社区。在iC建筑师区域设计，改造试剂；在网店进行iC的买卖；在iC社区学习，讨论，交流和获取商机。这篇博客主要介绍iC建筑师。
如果还不是注册试剂开发者，首先要注册获取帐号：
建立帐号的主要目的是建立开发者自己的，有密码保护的专用区域，这样才能对开发的内容保密。每个开发者所开发的所有试剂都有一个特定的帐号记录，今后这个试剂的特定帐号会放到卡盒的二维条码上，这样iCubate仪器才能知道用什么程序，如何做结果分析，如何展示结果。
如果已经是注册开发者了，就通过这个页面可以直接签入iC Architect区域：
进入iC建筑师区域以后，首先要做的是给出对iC的一般介绍：
首先要给你的iC取个名字，这个名字是要放到iC网店上去的，所以要简练，明了。 其次要对您所开发的试剂做一个简单的介绍：试剂的用途是什么？标本是什么？一共要同时扩增多少个靶点？是否需要检测点突变？注意，这里介绍试剂的应用范围等的内容要好好考虑，因为这是将来要放到网店中的卖你的产品的最佳“广告”。
接下来会看到这个网页：
根据上页里面填的靶点数，这里需要收集靶点特异性的信息：
首先是靶点的名称（比如流感病毒H1基因）。靶点名称很重要，它决定展示结果时的基本单位（比如，流感H1阳性）。其次，软件需要知道针对这个靶点，开发者要设计几个amplicon (扩增产物）。虽然对绝大多数多重PCR诊断试剂来说，最终产物里面一般一个靶点有一个扩增产物就够了，但是在开发阶段，为了节省时间（不是反复试那个amplicon 更敏感，特异性更强）可以做2-3个作为“保险”。因为引物现在已经很便宜了，所以可以这样做。如果为了省钱（可能需要多花些时间），也可以一个靶基因，一个amplicon。还有，碰到象SARS, 禽流感等对公共卫生危害很大的病原体，本身突变发生频率又很强的，可以考虑在最终产品里面多方几个amplicon，这样即使其中一个靶点发生了突变，其它靶点还可以协助诊断。
接下来是问针对特定的靶点，是否需要检测点突变？几个点突变？检测点突变就需要我们设计两个Primer Extension的引物，一个是野生型特异性的，另一个是突变型特异性的，然后用universal array上面的两个点的信号强度比来决定标本是否有突变。
如果你的靶点不含有点突变，只要把一段基因序列paste到给出的窗口就可以了。有些网友来信说不知道如何挑选特异性的靶基因片段。我们正在开发另外一个软件，（也会放到网上供大家免费使用）只要给出一个病原体的基因组序号（GenBank里面的序号）软件就自动挑出该基因组最具特异性的基因片段来。
根据我的经验，如果想找特异性的扩增靶点，最快的方法就是google. 比如找流感病毒的PCR靶点，就google "PCR, influenza, diagnosis" 就能发现很多论文描述real time PCR的引物设计。把别人设计的靶点扩大一些，他们扩增150碱基，我就去基因组切出五百碱基来作为设计引物的区域。
如果你设计的扩增靶点含有点突变，这个页面就会出来：
这里需要设计者指出点突变在你给出的序列中的位置，野生型的碱基和突变型的碱基分别是什么？
当把所有需要的信息输入后，按键进行多重PCR引物的全自动设计。电脑就会根据PPI程序和arm-PCR的原理直接计算出引物和探针的位置。
最后的设计结果这个网页会列出明细：
软件会给出每个靶点的每个引物的序列，包括primer extension用的探针的序列。点击靶点还可以看到一个展示PPI的图。
软件也容许设计者对引物进行微调，向前或向后做些移动。另外，每个靶点可能都有机套设计方案，如果首选方案不够理想，日后还可以选择其它引物组合。
如果（在美国）从和我们合作的引物合成厂家订购引物，第一批引物是免费的。这样研发的起始费用就更加低了。
有关PPI 和 arm-PCR的详细介绍我会另外写博客披露的。
从这个软件的流程大家可以看出，设计一个多重PCR的试剂实际很方便，有些经验的人大概不用一个小时就能完成了。虽然我们会在开发者注册时让用户签一个使用协议，说该软件（和其包涵的PPI，arm-PCR等专利技术）仅供那些开发iCubate技术平台专有试剂的人使用。我也知道一定有人会违约用这个软件开发多重PCR试剂然后用其它检测平台。如果那样会有几个致命的局限：（1）首先该用户就不能享受到全自动，全封闭的iCubate技术平台的好处，实验室污染迟早会发生。（2）而且，研发出的“产品”不能享用iC Store的国际化销售平台。（3）没有全自动和全封闭，产品进入市场难，报批难，使用范围毕竟受限。（4）如果不用iCubate平台，我们优化好的反应条件并没有公开，只有iCubate Processor根据卡盒上面的二维条码来给出最佳反应条件（PCR的扩增条件，arm-PCR的一些技术参数）, 所以多重扩增的成功率没有办法保障。所以，不用iCubate平台，占个小便宜，最后吃的是大亏。
类似的软件使用协议都是防君子不防小人的，目的主要是保护技术开发者，试剂开发者。开放平台的前提就是大家共同获利。我们尽最大的努力把平台做得更好，更方便，更便宜。也希望用户能珍惜这个机会，维护，共建这个平台。
春节过后，我们会在国内几个大城市举办一系列的培训班，感兴趣参与多重PCR试剂开发的请关注这个博客，最新消息会在这里发布的。
https://blog.sciencenet.cn/blog-290052-408525.html
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