科学研究是以科学方法为前提的。对于因果关系，必须采取可靠的方法才能够确立。英国心理学家、哲学家和经济学家约翰·穆勒（John Stuart Mill，1806-1873）所总结的“穆勒五法”是最早采用归纳法研究自然界因果关系的集大成者，下图是黄荣彬老师的博文“探求因果联系的穆勒五法”所绘出的关于推理方法的简单介绍。

“穆勒五法”包括“求同法”、“求异法”、“求同求异并用法”、“共变法”、“剩余法”等5种逻辑方法。现代医学验证化学药品和生物学制剂疗效的“大样本双盲对照实验”就是“穆勒五法”在医药领域的具体应用：个体有差异，需要大样本统计；疾病有自愈现象，需要对照（求异法）；人有心理作用，需要双盲。通过严格设计、严格操作的现代医药学试验，一般能够确定某种疗法的临床效应。

1890年，德国细菌学家罗伯特·科赫（Robert Koch）提出的“科赫法则”也是“穆勒五法”在病原微生物领域的具体应用。“科赫法则”为：（1）致病微生物必须存在于患病的所有宿主生物体内，而不存在于健康生物体内；（2）从患病生物中可分离到该微生物的纯培养物；（3）将培养物接种至敏感宿主时，同样的疾病必定再次发生；（4）从人工接种的宿主中，可再次分离得到这种微生物的纯培养物。

当年科赫宣称，只有同时满足这4个条件，才能确定某种微生物与特定传染病之间有因果关系。因为依据这4个条件，科赫令人信服地证明了炭疽病和结核病分别由炭疽杆菌和结核杆菌引起。100多年来的大量事实证明，科赫法则有绝对化之嫌。科赫当年也已认识到，某些病原体确实引发了传染病，但它们并不完全满足该法则的所有条件。

科赫发现，霍乱病原体（霍乱弧菌），从病人和健康人体内都能分离到，这明显与第1个条件不相符。无症状携带或隐性感染是许多传染病的共同特点，另一个典型例子是脊髓灰质炎病毒，它仅在约1％的感染者中引起瘫痪性疾病。

第2和第4个条件不适用于不能在培养细胞中复制的病毒，也不适用于没有合适的动物模型的病毒。例如，引起克雅氏病的朊病毒和引起丙型肝炎的病毒都无法获得纯培养。

对于第3个条件，我们要充分考虑宿主对病原微生物的敏感性的差别。科赫在1884年就发现，有些个体对霍乱、结核等疾病有抵抗力。现在我们知道，宿主的敏感性取决于其遗传、年龄、营养状况、免疫状况等许多因素；某些人天生对疟疾有免疫力，还有些人天生对HIV有抵抗力。

同一种病原体的感染可能会导致明显不同的疾病，例如引起水痘和带状疱疹的是同一种病毒，在孕期感染风疹病毒则可能引发畸胎。不同的病原体也可能导致相同的疾病，例如多种细菌和病毒都可引起感冒症状。这些情况都是我们在应用科赫法则时必须注意的。

对传染病病原体的确认，科赫法则规定的是充分条件，不是必要条件。科赫法则代表了一套在理论上十分完美的判定标准。目前，虽然科赫法则的应用有一定灵活性，但对不能符合的条件，科学家必须作出合理的解释；科赫法则的基本原则是不能违背的。

基因组时代的生物技术，包括聚合酶链反应（PCR）、微芯片、高通量测序等，可以提供更加快速、灵敏、简便、廉价的方法直接进行微生物病原的检测。这些检测主要借助于仪器自动完成，往往能在1-2天的时间内，得到检测样品中所有核酸的序列资料，即得到所有可能含有的微生物基因序列的遗传信息。基于核酸的检测方法极其灵敏，甚至可在疾病尚未发生时检测出极少量的病毒。

为鉴定宿主或病原微生物所需的基因序列数据库正在快速扩张，扩张速度也遵循“摩尔定律”：数据库的信息量每两年增长50%。此类数据库几乎包括所有已完成测序的生物（包括各种病原微生物）的基因组序列。借助计算机，将样品中的序列与数据库中的序列进行比对，即能初步确定样品所含病原体的类型。

对急性传染病的病原鉴定相对比较简单，而对慢性传染病的病原鉴定通常很复杂，因为后者涉及的微生物的致病机制可能是间接或微妙的。在这些情况下，往往需要收集更多的流行病学资料进行统计学分析和综合评估；同时还要在宿主体内用多种方法寻找病原体的踪迹（如核酸、抗原、特异性免疫反应等）。

目前微生物病原快速鉴定的首选方法均以核酸序列测定为基础，通常不再依赖于细胞培养或动物模型。这使科赫法则更难直接套用，因此有必要对该法则进行修订。美国斯坦福大学医学及微生物学与免疫学教授戴维·雷尔曼（David Relman）和同事提出了基因组时代的科赫法则：

（1）属于假定病原体的核酸序列应该出现在特定传染病的大多数病例中。在已知的患病器官或明显的解剖学部位，应能发现该微生物的核酸，而在与相应疾病无关的器官中则不会发现。

（2）在未患病的宿主或组织中，与病原体相关的核酸序列的拷贝数应当较少或完全检测不到。

（3）随着疾病的缓解，与病原体相关的核酸序列的拷贝数应减少或检测不到。如果临床上有复发，则应该发生相反的情况。

（4）当序列检测预示疾病将发生，或序列拷贝数与疾病的严重程度有相关性，则序列与疾病的联系极可能构成因果关系。

（5）从现有序列推断出的微生物特性应符合该生物类群的已知生物学特性。

（6）应在细胞水平探求患病组织与微生物的关系：用原位杂交来显示发生了组织病理变化的特定区域，以证明微生物的存在，或显示微生物应该存在的区域。

（7）这些以序列分析为基础获得的上述证据应当是可重复获得的。

注：本文参考了2010年第11期严家新研究员在“Scientific American”中文版《环球科学》刊载了的“基因组时代的科赫法则”。