资料来源：生信番茄 2024-01-25 19:00 发表于上海

在国际顶刊的杂志中，关于中医药研究的文章十分少。这是因为中医药研究在国际学术界一直面临着诸多挑战，如研究方法、实验标准和国际认可度等方面的问题。然而，我国科研团队在中医药研究领域不断努力突破，取得了令人瞩目的成果。

近日，海军军医大学张卫东课题组在Nature子刊上发表的《芪甲苷衍生物HHQ16通过降解lncRNA4012/9456改善梗死引起的肥大和心力》一文，引起了轰动，再次证明了中医药研究的巨大潜力。这项研究的突破，不仅有助于提升中医药在国际学术界的地位，还为中药现代化、国际化发展奠定了基础，推动中医药在世界范围内的传播与发展。

下面番茄君带领大家一起来看看这项研究的创新之处和重大突破的点：

1.本研究中报道了一种新型小分子HHQ16，它通过直接作用于心肌细胞逆转肥大，有效逆转梗死引起的心肌重塑并改善心脏功能。并且，HHQ16的作用与心脏中新发现的lnc9456的强烈抑制有关。

2.本研究中全面表征了新发现的人类lncRNA (lnc4012)及其小鼠同源物(lnc9456)，作者新发现的lncRNA，为心肌肥厚和心力衰竭中的发病机制提供了新的见解，中医药领域的研究打开了新的大门！

3. 本研究中发现HHQ16通过靶向降解病理性升高的lnc4012/lnc9456是一个新的小分子的真正靶点，可能是消退梗死引起的心脏肥大和心衰的一种有前途的新策略。此次研究成果的发表，对于中西医理论结合、中药现代化发展具有重要的意义，为中医药在临床治疗心肌肥厚和心力衰竭提供了新思路。

题目：黄芪甲苷衍生物HHQ16通过降解lncRNA4012/9456改善梗死引起的肥大和心力衰竭

杂志：Signal Transduct Target Ther.

影响因子：IF=39.3

发表时间：2023年10月

张卫东教授，中药及复方药效物质基础与创新药物研究专家，中国医学科学院学部委员，中国医学科学院药用植物研究所执行所长，中国人民解放军海军军医大学药学系天然药物化学教研室主任、教授。张卫东教授长期致力于天然药物化学、中药及复方的药效物质基础、作用机理以及创新药物研究，主持国家863基金、国家自然科学基金、国家新药基金等16项基金课题。在国内外发表论文182篇，其中SCI收录杂志发表论文100篇，EI收录5篇，出版专著2部。国内发明专利20项，国际发明专利1项。   

研究背景

心肌梗死后心室重塑（MI）是发生心力衰竭（HF）最常见的原因。与逆向重塑的患者相比，HF治疗后无肥大消退的的患者生活质量较差，死亡率增加。将心肌细胞大小和心室几何形状恢复到更正常的水平与心脏功能的改善以及心肌分子、代谢和细胞外基质特性的过程被称为重塑可逆性。因此，靶向性的肥大消退可能是心室重塑和心衰的潜在治疗策略。然而，肥大消退的分子机制仍有待阐明，目前尚无可在心肌细胞水平上直接逆转现有肥大的疗法。

黄芪是临床上常用的治疗慢性心衰的中药，目前已有科学证据表明黄芪中的主要活性成分黄芪甲苷IV显著逆转了实验性慢性心衰的不良重塑。因此，黄芪甲苷 IV 可能为新药开发提供有价值的候选化合物。本研究中，作者优化了一种名为HHQ16的黄芪甲苷IV的新型小分子衍生物，它通过直接作用于心肌细胞产生抗肥厚作用，有效逆转心肌梗死后重塑并改善心脏功能。

主要结果

1.HHQ16显著改善了梗死诱导的HF小鼠的心脏功能并逆转了心肌重塑

本研究中作者使用了一种新的小分子黄芪甲苷衍生物—HHQ16，研究了 HHQ16 对左前降支冠状动脉结扎术 （LADL） 诱导的缺血引起的 HF 小鼠的影响。

（1）与假手术对照组小鼠相比，LADL手术后4周小鼠的左心室射血分数（LVEF）和左心室分数缩短（LVFS）显著降低，提示LADL损害了心脏功能（图1c、d）。      

随后选择依那普利（ACEI类）和LCZ696（ARNI类）两种治疗心衰的一线药物作为阳性，以对照剂或HHQ16以不同剂量每天强饲法处理这些小鼠，再持续4周，结果发现：   

（2）在LADL后第8周结束时，对照溶剂组小鼠的LVEF和LVFS较第4周进一步下降，表明HF进展发展。相比之下，接受HHQ16的小鼠的LVEF和LVFS以剂量依赖性方式显著增加（图1 d）。10 mg/kg的HHQ16对LVEF和LVFS的改善效果最好，与依那普利（2 mg/kg）治疗效果相当，但优于LCZ696（100 mg/kg）。

（3）HHQ16显著降低了扩大的心脏尺寸和心脏重量与体表面积之比（图1e）。

（4）H&E和Masson染色显示，HHQ16通过减少细胞体积（大小）和滑动（无序排列的肌细胞）显著逆转LADL诱导的肥大（图1f）以及纤维化（图1g）。

（5）电子显微镜下观察到HHQ16治疗之后，线粒体形态也通过恢复（图1h）。

综上所述，这些结果证明HHQ16治疗可以有效逆转LADL诱导的小鼠心脏功能恶化和结构重塑。   

图1 新分子 HHQ16 显著改善心功能并逆转 HF 小鼠的心肌重塑

2. HHQ16直接作用于心肌细胞，产生抗肥厚作用

为了研究 HHQ16 对 HF 影响的分子机制，作者使用 RNA 测序的过滤和验证策略来分析差异表达的转录物。结果发现，受HHQ16影响的差异mRNA主要富集于扩张型心肌病和肥厚型心肌病以及肥厚标志物β-Mhc、Anp和Bnp（图2a），这提示HHQ16对心脏肥大具有突出的调节作用。

（1）WGA染色显示，HHQ16通过减小细胞体积（大小）显著降低LADL诱导的肥大（图 2c）。 

（2）在转录和蛋白质水平上，LADL诱导的ANP、BNP和β-MHC的增加也被HHQ16逆转（图2d，e）。

（3）Phalloidin染色分析进一步证实，HHQ16直接作用于体外心肌细胞，并限制了其由ISO+PE刺激诱导的体积扩张（图2f），而不涉及心脏组织中的其他细胞。

（4）HHQ16还逆转了由ISO刺激原代小鼠心肌细胞诱导的ANP和BNP肥大表达的增加（图2g–h），但不影响其增殖活性。

综上，这些数据表明，通过HHQ16治疗，肥大的心肌细胞可以恢复到更正常的大小，这应该是HHQ16逆转梗死诱导的重塑和HF的作用的原因。          

图2  HHQ16 通过直接作用于心肌细胞来抑制心脏肥大    

3. HHQ16 的作用与对新的 Egr2 附属转录本 lnc9456的强烈抑制有关

为进一步阐明HHQ16在肥厚标志物β-Mhc、Anp和Bnp中转录抑制的机制，作者进一步分析了lncRNAs测序数据（图3a，b）。

（1）以P < 0.05和倍数变化（FC）≥5或≤0.2为显著性差异阈值，共鉴定出小鼠心脏中35个lncRNA，其中有23个在HF中上调的lncRNAs被HHQ16下调（图3a）。

（2）通过qRT-PCR在LADL处理的小鼠和ISO或Ang II刺激的原代小鼠心肌细胞中进一步验证了这些结果，并最终通过HHQ16筛选出ENSMUST00000219456（lnc9456）作为受影响最大的lncRNA。

（3）lnc9456在肥大的心脏中显著增加约17倍，而其肥大被HHQ16显著抑制（图3a，右）。HHQ16还显著抑制ISO、AngII或ISO+PE诱导的原代或HL-1心肌细胞中lnc9456的高表达（图3b，c）。

综上，这表明HHQ16对心肌肥大和HF的影响与新的Egr2相关转录物lnc945的强烈抑制有关。   

图3  筛选出一种新的被HHQ16强烈抑制的转录物lnc9456

4.Lnc9456 对心肌细胞肥大至关重要

（1）Lnc9456在正常心脏中几乎无法检测到，但在接受 LADL 的肥大和衰竭小鼠心脏中高度表达（图4a）。

（2）在这些病理应激下，lnc9456持续上调，并伴随着肥大生物标志物如ANP和BNP的表达平行增加（图4a，b），表明lnc945可能是驱动心肌细胞肥大的致病因素。

（3）为了确定lnc9456在心肌细胞肥大中的功能作用，作者首先使用重组腺病毒（AdV）在体外HL-1小鼠心肌细胞中过表达lnc9456。与阴性对照相比，感染AdV6-lnc9456的心肌细胞细胞大小显著增大（图4c），并且在转录和蛋白质水平上肥大生物标志物ANP、BNP和β-MHC的表达更高（图4d，e），这表明单独增加的lnc9456表达足以诱导心肌细胞肥大。

（4）当用智能沉默核糖核酸（ssRNA）敲低lnc9456时，ISO+PE诱导的心肌细胞肥大的作用被消除（图4f，g），表明lnc945在神经激素激活驱动的心肌细胞肥厚中的关键作用。   

图4  Lnc9456对心肌细胞肥大至关重要

5.Lnc9456 与 G3BP2 相互作用并促进 NF-κB 信号通路

为了探究lnc9456对心肌细胞肥大影响的下游机制，作者使用使用catRAPID筛选可能与lnc9456相互作用的潜在蛋白。Ras-GTPase激活蛋白（SH3结构域）结合蛋白2（G3BP2）与lnc9456直接相互作用的可能性最高。

用生物素化的lnc9456探针（Sense-lnc9456）和反义转录物（Antinse-lnc945）在体外进行RNA下拉测定。共鉴定出 2113 个与 lnc9456 结合的蛋白，并对这些蛋白进行功能性 GO 和 KEGG 分析。在GO分析中表明G3BP2（图5b）。进一步的追踪分析表明， 包含在这些项目中与lnc9456结合的蛋白质的主要功能是RNA结合（图5b）。

为进一步验证这一观察结果，作者首先检查了LADL是否对G3BP2的表达有任何影响，结果表明：

（1）Western分析表明，小鼠体内的 LADL 引起 G3BP2 表达的时间依赖性增加，这与时间依赖性心脏功能受损和 lnc9456 以及肥厚标志物 ANP、BNP 的增加同时发生（图4a）。

（2）具体而言，当lnc9456的表达受到干扰时，G3BP2的蛋白水平降低（图5c）；而在lnc9456高表达的细胞中，G3BP2的蛋白水平相应增加（图5e）。这表明表明lnc945 6和G3BP2之间存在内在关系。

（3）蛋白质印迹分析显示，只有lnc9456过表达的细胞的裂解物中才有正义链与G3BP2的结合，但在对照条件下，正义链和反义链都没有与G3BP2-结合（图5f），这表明G3BP2-与lnc9456-结合需要高水平的lnc9456。

先前的研究报道，G3BP2可能能够与IκBα结合，从而促进NF-κB亚基p65的核聚集，启动肥大基因转录并诱导心肌肥大。但尚不清楚G3BP2与IκBα的结合在心肌肥大发展过程中增加的原因和方式。

（1）在本研究中作者通过共免疫沉淀（Co-IP）测定证实lnc9456的过表达能够增强G3BP2与IκBα的结合（图5g）。

（2）免疫荧光显示lnc9456过表达显著促进NF-κB亚基p65的核聚集（图5h）。

综上所述，这些结果有力地证实了在病理应激下高水平的lnc9456增加了lnc9456G3BP2的相互作用，并促进了NF-κB亚基P65从细胞质向细胞核的易位，从而激活了一系列肥大基因并加重了心功能。       

图5  Lnc9456 与 G3BP2 相互作用并促进 NF-κB 的 p65 亚基的核易位

6.HHQ16 以高亲和力直接与 lnc9456 结合并诱导其降解

Lnc9456 是一种促肥厚因子，HHQ16对心肌肥厚和心衰的影响可能是通过靶向 lnc9456 来实现的。本文进一步探讨了HHQ16如何调控lnc9456的表达。结果显示，HHQ16显著降低了lnc9456的半衰期（图6a），并且仍然有能力降低AdV-lnc9456-诱导的心肌细胞中lnc945的高表达（图6b），强烈暗示这种调节可能发生在转录后水平。为了证实这一观点，在体外转录系统中进一步检测了HHQ16对lnc9456稳定性的影响，结果发现：

（1）HHQ16以时间和剂量依赖的方式降低体外转录的lnc9456的水平（图6d，e）。

（2）重要的是，HHQ16对lnc9456的降解仅在心肌细胞裂解物存在的情况下发生（图6c）。

这些结果促使我们探究它们之间是否存在相互作用。如预期那样，微尺度热泳（MST）的数据显示：HHQ16与lnc9456具有高亲和力，Kd为15.3μM（图6f，左）但对抗高营养化lncRNA Mhrt没有显示出任何亲和力（图6f，右）。

综上，HHQ16可以特异性地靶向与lnc9456的结合，并促进其在心肌细胞中的降解。

图6  HHQ16 以高亲和力直接与 lnc9456 结合并诱导其降解

7.Lnc9456 对 HHQ16 逆转小鼠心脏肥大和功能障碍至关重要

HHQ16可以在体外降解转录的lnc9456，本研究进一步评估了增加lnc9456对心脏的影响以及HHQ16在体内的作用。作者构建了由特异性cTNT启动子驱动的腺相关病毒AAV-lnc9456，并将其直接注射到小鼠心脏中，以诱导lnc945的心肌细胞特异性过表达。

结果发现：与对照小鼠（AAV Vector）相比：AAV-lnc9456小鼠中lnc945在心脏中的表达显著增加，其LVEF和LVFS降低（图7a，b），总心脏更大（图7c），重量更重（图7d），单肌细胞尺寸更大（图7e），在转录和蛋白质水平上肥大生物标志物ANP、BNP和β-MHC的表达水平更高。

这些结果表明，在没有心肌梗死应激的情况下，单独使用心肌细胞特异性过表达lnc9456就足以诱发心脏肥大和功能障碍。

图7  Lnc9456 是 HHQ16 逆转小鼠心脏肥大和功能障碍的关键

同时，为了评估lnc9456功能丧失对心脏和体内HHQ16活性的影响，本研究通过将lnc9456flox/flox小鼠与Myh6-Cre转基因小鼠杂交，产生lnc9456CKO（敲除等位基因）和lnc9456b/f（对照）后代。对lnc9456f/f和lnc9456CKO小鼠进行LADL，并用超声心动图监测其心功能。结果发现：   

（1）与lnc9456f/f小鼠相比，lnc9456CKO小鼠的LVEF和LVFS均显著升高（图7f，g）。

（2）lnc9456CKO小鼠的心脏大小更小（图7h）， HW/BSA 比值更低（图7i），7i），单个肌细胞大小更小（图7j），肥大生物标志物ANP，BNP和β-MHC的表达降低。

这表明心肌细胞特异性敲除lnc9456可以保护心脏功能，防止LADL诱导的适应不良重塑和HF的发展。

8.人直系同源物 lnc4012 是 HHQ16 的真正靶标

本研究中作者还对lnc9456的直系同源物在人类心脏中做了进一步鉴定，结果发现，LOC107984012（lnc4012）是10号染色体上EGR2基因上游的唯一基因，编码一种新的1064核苷酸lncRNA。与健康供体的心脏相比，在扩张型心肌病患者的衰竭心脏中，lnc4012的表达显著上调了36.06±11.35倍（图8a），这表明lnc4012上调与心肌肥大和HF密切相关。

为了进一步确定这种新发现的lnc4012在心脏中的功能，本研究中作者使用ISO在体外处理人心肌细胞的细胞系AC16细胞。结果发现：如图8b所示，ISO不仅刺激了肥大生物标志物ANP、BNP和β-MHC的表达，而且以剂量依赖的方式增加了lnc4012的水平，这表明lnc4012的上调确实与肥大基因转录增加和心肌肥大的发展密切相关。

用生物素化lnc4012探针在体外进一步进行RNA下拉测定，以探索其下游机制。结果发现：

（1）与lnc9456一样，生物素化的人lnc4012感测探针（sense-lnc4012）能够在lnc4012过表达心肌细胞的洗脱液中捕获更多内源性G3BP2（图8c）。

（2）与对照（OE Vector）相比，仅在4012过表达的洗脱液中检测到IκBα（图8d）。同时，lnc4012的过表达也促进了NF-κB p65从细胞质向细胞核的易位（图8e）

（3）此外，HHQ16对lnc4012具有更高的亲和力（图8f），高于其小鼠直系同源物lnc9456，并以时间依赖的方式促进体外转录的lnc4012的降解（图8g）。

（4）在人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSC CMs）中，HHQ16显著降低了ISO诱导的lnc4012的表达（图8h）。

综上，这些结果横向证实了鼠lnc9456和人lnc4012分子机制的一致性，支持了人类直系同源物lnc4012是HHQ16逆转病理性肥大和HF的真正靶点的观点。  

图8  人直系同源物 lnc4012 是 HHQ16 的真正靶标   

文章小结

总的来说，这篇文章全面深入地研究了黄芪氏衍生物HHQ16在改善心梗导致的肥大和心力衰竭方面的作用。本研究从动物实验到临床验证，层次清晰，逻辑严谨。全面表征了新发现的人类lncRNA（lnc4012）及其小鼠直系同源物（lnc9456），并为lnc4012/lnc9456在MI诱导的肥大和HF发展中的作用提供了新的机制见解。我们还提供了令人信服的证据，证明lnc4012/lnc9456是一种新的小分子HHQ16的真正靶点，通过特异性结合lnc4012/lnc9456，导致其降解，并拮抗其对心肌细胞中G3BP2/NF-κB信号传导的作用，有效逆转梗死诱导的肥大和HF。