资料来源：退休也养生，2022-01-12 09：00

2021年10月13日，马秋富教授团队与复旦大学王彦青教授，中国中医科学院针灸研究所景向红教授团队合作，在《Nature》发表文章《A neuroanatomical basis for electroacupuncture to drive the vagal-adrenal axis》，实现了针灸研究的历史性突破。此研究揭示了一类PROKR2-Cre标记的DRG感觉神经元，在低强度针刺刺激激活迷走神经-肾上腺抗炎通路中扮演着必不可少的角色。尤为值得关注的是，根据此类神经的躯体分布特点，可以预测在不同部位低强度电针刺激抗炎的效果，从而为穴位相对特异性的存在提供了现代神经解剖学基础。

摘 要

体感自主神经反射允许电针刺激(ES)调节远处部位的身体生理机能（例如，抑制严重的全身炎症）。自1970年代以来，关于这些反射的新兴组织规则一直是身体区域特异性的存在。例如，后肢足三里（ST36）穴位的ES而不是腹部天枢（ST25）穴位的ES可以驱动小鼠的迷走神经-肾上腺抗炎轴。然而，这种躯体组织的神经解剖学基础是未知的。在这里，该研究展示了PROKR2 Cre 标记的感觉神经元，其支配深后肢筋膜（例如，骨膜）而不是腹部筋膜（例如，腹膜），对于驱动迷走神经-肾上腺轴至关重要。在具有消融的PROKR2 Cre 标记的感觉神经元的小鼠中ST36位点的低强度ES未能激活后脑迷走神经传出神经元或驱动肾上腺释放儿茶酚胺。因此，ES不再抑制由细菌内毒素引起的全身炎症。相比之下，在ST25和ST36位点由高强度ES诱发的脊髓交感神经反射不受影响。该研究还表明，通过ST36位点对PROKR2 Cre 标记的神经末梢进行光遗传学刺激足以驱动迷走神经-肾上腺轴，但不能驱动交感神经反射。此外，PROKR2 Cre 神经纤维的分布模式可以回顾性预测低强度ES会或不会有效产生抗炎作用的身体区域。该研究为穴位在驱动特定自主神经通路中的选择性和特异性提供了神经解剖学基础。

结 果

1  PROKR2 Cre神经元对筋膜的神经支配

为了表征PROKR2 Cre 神经元，使用 Prokr2 Adv -tdTomato 小鼠，其中tdTomato报告基因仅限于由PROKR2Cre和AdvillinFlpo的发育共表达定义的DRG神经元（补充数据图1a）。在一部分DRG神经元中检测到PROKR2 ADV -tdTomato+细胞（图1b、c），但在交感神经节、肾上腺或肠神经节中未检测到，并且在结节状神经节中很少见到（补充数据图1b）。值得注意的是，PROKR2 ADV DRG神经元在肢体水平比在胸部水平具有更高的表现（补充数据2a，b），与L4-L5腰椎DRGs相比，16.7±1.4%（平均值±SEM）的TUBB3+神经元共表达tdTomato在T8-T10胸椎DRG中为6.1±0.3%（图1b、c）。在腰椎DRGs中，PROKR2 ADV 神经元不与IB4结合非肽能神经元重叠，后者支配皮肤表皮或表达小清蛋白的本体感受器（补充数据图1c）。在tdTomato+神经元中，82.9±1.2%共同表达神经生长因子受体TRKA，57.2±1.8%共同表达神经丝蛋白NEFH，63.9±3.6%共同表达降钙素基因相关肽（CGRP），50.7±3.9%共同表达NEFH和CGRP（补充数据图1c）。此外， Nefh mRNA表达水平显示， Nefh + tdTomato+神经元被分为 Nefh high 和 Nefh low 亚型。Nef high 亚型占L4-L5 DRG中TUBB3 + 神经元的7.5±0.8%，是T8-T10 DRG中数量的三倍多（2.0±0.1%）（图1b，c）。相比之下，Nefh low 亚型在腰椎（2.7±0.3%）与胸椎（2.1±0.2%）DRGs中没有显示任何明显的代表性差异（图1b，c）。因此，Nef high PROKR2 ADV 神经元在肢体级DRGs中富集。

我们接下来描述了神经支配模式。在中央，PROKR2 ADV 神经元主要支配脊髓背侧的浅层，而深层神经元的支配程度较低（补充数据图2c，d）。

在外周，对于后肢和腹部区域，tdTomato + 纤维不支配皮肤表皮，但在毛囊周围形成周向末梢。这些末梢显示强烈的CGRP表达，但没有检测到NEFH蛋白的表达（补充数据图3b，c）。几乎所有从皮肤逆行标记的tdTomato + 神经元都共同表达了 Bmpr1b 和低水平的 Nefh mRNA（补充数据图3d，e），代表了Aδ神经感受器的CGRP-ε亚型16,17,18。通过检查深层组织的神经支配，我们发现了身体区域的差异。在后肢，tdTomato + 纤维密集地支配着筋膜组织，包括骨膜、关节韧带和胫骨与腓骨之间的骨间膜（图1d，补充数据图4a-c）。共有63.5±4.1%的骨膜支配的tdTomato + 纤维共同表达了NEFH和CGRP（扩展数据图4d）。NEFH + tdTomato + 纤维也大量支配胫骨前肌（TA）的内室，该空间可能与包裹肌束的筋膜有关（补充数据图4e）。PROKR2 ADV -tdTomato + 神经元占ST36深层组织逆行标记的神经元的38.7±1.3%。其中，75.6±1.3%共同表达高水平的 Nefh mRNA，只有10.6±1.0%共同表达 Bmpr1b 和12.5±1.0%低水平的 Nefh mRNA（补充数据图4f、g）。这种表达情况使它们与支配毛囊的 Bmpr1b + Nefh low PROKR2 ADV -tdTomato + 神经元相区别。与后肢深筋膜的密集神经支配相反，在腹膜中没有检测到tdTomato + 纤维，而腹膜是腹部的主要深筋膜（图1e）。值得注意的是，与ST36部位的内侧TA相比，ST25部位的外侧TA或腹壁肌肉中的tdTomato+纤维密度要低10倍（补充数据图4h），这与两个TA区间的发育和功能隔离相呼应。因此，NEFH high tdTomato + 神经元对深筋膜组织的独特支配提供了一种区分后肢ST36区和腹腔ST25区的方法（补充数据图4i, j）。

PROKR2-Cre标记的有髓鞘的神经元主要富集表达于支配四肢节段的DRG中，并且此类神经元特异性支配四肢的深层筋膜组织（如骨膜、关节韧带和肌筋膜等），而不支配皮肤的表皮组织和腹部的主要筋膜组织（如腹膜）。

2  驱动迷走神经-肾上腺轴的必要性

为了研究PROKR2 ADV 神经元的功能，使用Prokr2 Adv- DTR小鼠，其中白喉毒素（DTX）受体（DTR）的表达被限制在PROKR2 ADV DRG神经元（补充数据图5a，b）。注射DTX四周后，98.0±0.5%的PROKR2 Cre 标记的DRG神经元被消融（补充数据图5c），这导致骨膜中TUBB3 + 和NEFH + 纤维密度分别减少了44.5±7.0%和72.4±5.7%（补充数据图5d）。值得注意的是，在脊髓或大脑中没有观察到消融（补充数据图5e）。我们将这些小鼠称为PROKR2 ADV -Abl。

为了确定PROKR2 ADV 神经元是否驱动迷走神经-肾上腺轴，我们对后肢ST36穴位进行了ES（图2a）。将一对电针插入双侧TA肌肉，针尖靠近腓肠神经（图2a，补充数据图3a）。在对照组小鼠中，低强度（0.5mA）的ES足以诱导Fos的表达，这是神经元激活的标志，位于迷走神经背侧运动核（DMV）的后脑迷走神经传出神经元中，并以胆碱乙酰转移酶（ChAT）的表达为标记（图2b）。这种Fos诱导在PROKR2 ADV -Abl小鼠中被消除了（图2b）。ST36位点的0.5毫安ES可引起肾上腺绒毛细胞释放去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺，这种释放依赖于迷走神经。这种释放在PROKR2 ADV -Abl小鼠中几乎被消除（图2c），这表明PROKR2 ADV 神经元在低强度ES对迷走神经-肾上腺轴的激活中有作用。

迷走神经-肾上腺轴的激活可以抑制由细菌内毒素脂多糖（LPS）诱发的系统性炎症。在没有LPS处理的情况下，促炎症细胞因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-6（IL-6），在血清中几乎检测不到（拓展数据图6a）。在LPS处理的对照组小鼠中，与假ES相比，ST36部位的0.5-mA ES导致TNF和IL-6的诱导减少50%，存活率增加40%，这些效应在PROKR2 ADV -Abl小鼠中被取消（图2d-g）。我们以前曾报道过，腹部ST25穴位的0.5毫安ES不能驱动迷走神经或交感神经反射，也不能抑制全身性炎症。ST25穴位的高强度ES可以驱动交感神经反射，并产生独立于迷走神经传出的弱（通过1.0-mA ES）或强（通过3.0-mA ES）抗炎作用。这些效应在PROKR2 ADV -Abl小鼠中没有变化（补充数据图6b-j）。后肢ST36穴位的高强度（3.0-mA）ES也驱动脊髓交感神经反射并产生独立于PROKR2 ADV 神经元的抗炎作用（补充数据图7a, b）。因此，PROKR2 ADV 神经元是低强度ES驱动后肢ST36穴位的迷走-肾上腺抗炎轴的唯一需要。

3  驱动肾上腺轴的必要性

我们接下来通过Prokr2 Adv -CatCh小鼠进行功能增益研究，其中钙转运通道Rhodopsin（CatCh）和增强型黄色荧光蛋白（eYFP）的表达被限制在PROKR2 ADV 神经元中（补充数据图8a）。电生理记录表明，蓝光脉冲在Prokr2 Adv -CatCh小鼠的DRG神经元子集中诱发了动作电位发射，但在对照组小鼠中却没有（补充数据图8d，e）。

然后，我们通过ST36部位将光学纤维双侧插入TA内侧，进行光针治疗（图3a）。蓝光刺激未能驱动交感神经反射（拓展数据图8f，g），因此我们把重点放在迷走神经反射上。以前的研究显示，脊髓的上升投射到延髓的孤束核（NTS），它将输出到DMV。ST36部位的光学刺激使从NTS逆行标记的第一层脊髓神经元的Fos诱导从对照组的3.3±0.9%增加到Prokr2 Adv -CatCh小鼠的52.7±7.1%（拓展数据图9a, b）。此外，DMV内ChAT+迷走神经元的诱导率从对照组小鼠的10.8±1.4%增加到Prokr2 Adv -CatCh小鼠的30.2±1.8%（图3b）。一致的是，左颈迷走神经的电生理记录（拓展数据图8g）显示，对ST36部位的双边光学刺激，放电率增加了15倍（图3c）。同时，与对照组相比，蓝光刺激ST36穴位引起Prokr2 Adv -CatCh小鼠血清中去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺水平的增加（图3d）。膈下迷走神经切断后，这种增加被消除了（图3d）。由于循环中的肾上腺素和多巴胺主要来自肾上腺，这些数据表明，PROKR2 ADV 神经元的激活足以驱动迷走神经-肾上腺轴。一致的是，ST36位点的蓝光刺激导致从肾上腺逆行标记的迷走神经元的Fos诱导增加（从对照组小鼠的12.1±2.3%到Prokr2 Adv -CatCh小鼠的47.7±3.7%（补充数据图9c、d）。此外，蓝光刺激ST36穴位后，与对照组小鼠相比，LPS处理的Prokr2 Adv -CatCh小鼠的TNF和IL-6的产生减少了50%，存活率增加了50%（图3e-g，补充数据图9e）。膈下迷走神经切断后，这种抗炎作用消失（图3e，f）。因此，PROKR2 ADV 纤维的光学激活基本上模仿了ST36的0.5-mA ES，并能充分驱动迷走神经-肾上腺抗炎轴。

为了研究PROKR2-Cre标记的神经元在针刺诱导迷走神经-肾上腺抗炎通路中的作用，研究团队运用交叉遗传等方法特异性地敲除此类DRG感觉神经元。当敲除这类神经元后，低强度针刺刺激后肢穴位ST36不能激活迷走神经-肾上腺通路，也无法抑制LPS（细菌脂多糖）所诱发的炎症风暴；而敲除此类神经元并未影响高强度刺激后肢穴位ST36和腹部穴位ST25所诱导的交感神经抗炎通路。

4  肢体深层筋膜神经受累

PROKR2 ADV 神经元同时支配皮肤和深层组织，NefhlowBmpr1b+亚群以与区域无关的方式支配毛囊，Nefhigh神经元优先支配后肢筋膜组织（补充数据图4i、j）。为了实现身体区域的特异性，迷走神经反射可能是由腓总神经诱发的，它含有支配深筋膜的纤维，而不是由支配皮肤的外侧皮神经。为了验证这一假设，我们产生了选择性切断腓总神经或外侧皮神经的小鼠（分别称为CPX和CLX），加上接受假手术的对照小鼠（图4a）。在CPX小鼠中，病灶电刺激和插针至3毫米深度，消除了ST36部位0.5-mA ES诱导的TNF和IL-6产生的抑制作用，骨膜和前侧深层肌肉的神经支配选择性地丧失。在横断胫神经位于腓骨和胫骨后方的小鼠中没有观察到这种效果（图4b，c，补充数据图10a），即使胫神经激活，通过扩散的ST36 ES模式诱发，可以产生抗炎作用10。一致的是，在CPX小鼠中，由ST36部位的0.5毫安ES诱发的NTS投射脊柱神经元的Fos诱导被消除了（补充数据图10b）。相比之下，抗炎作用在CLX小鼠中没有受到影响，ST36部位的皮肤神经被选择性地消除了（图4d，e）。一致的是，ST36穴位的表皮内0.5mA的ES未能产生抗炎作用（补充数据图11a，b）。此外，通过承筋(BL56)穴插入电针，在后腹中线区域进行0.5mA的ES时，没有诱发抗炎作用，针尖位于皮肤神经的侧面（补充数据图11c，d）。因此，迷走神经-肾上腺抗炎轴可能是由支配肢体深筋膜的PROKR2ADV感觉纤维介导的（图4f）。

5  由神经支配所预测的ES效应

最后，我们测试了PROKR2 ADV 感觉纤维的神经支配模式是否可以回顾性地预测低强度ES可以或不能驱动抗炎作用的身体区域。与PROKR2 ADV 感觉纤维在TA内侧肌肉（补充数据图4d，e）的突出支配相反，PROKR2 ADV 感觉纤维在后部肌肉显示出稀疏的支配，包括在hindlegs的腓肠肌和大腿区域的半腱肌（补充数据图11f，i）。一致的是，这些肌肉中的0.5mA的ES未能抑制TNF和IL-6的产生（补充数据图11e-j）。值得注意的是，腓肠肌和半腱肌不包含传统的穴位，经常被用作非穴位对照10,25,26。对于一个积极的预测，应该注意到PROKR2 ADV 神经元也富集在支配前肢的颈部C6-8 DRG中（补充数据图2a，b）。因此，我们对手三里（LI10）穴进行了双侧0.5mA的ES，针尖靠近桡神经的深部分支，该神经含有支配桡骨骨膜的tdTomato + 纤维（补充数据图11k，l）。这种刺激减少了TNF和IL-6的产生，而这取决于PROKR2 ADV 神经元和迷走神经（补充数据图11m，n）。

讨 论

我们的研究为穴位选择性（如有效的 ST36、LI10 和无效的 ST25穴位）和穴位特异性（如ST36 与无效的后肢肌肉中的传统非穴位）在驱动特定的自主神经通路：迷走-肾上腺轴方面的存在提供了神经解剖学解释。我们认为，在针灸领域争论已久的穴位特异性是一个可操作的定义，它取决于刺激强度、针的深度和检测结局指标。这些发现可以为优化针刺等体表刺激提供科学依据，优化针灸临床参数，以驱动不同的自主神经通路来治疗特定的疾病。

翻译：孙亚男（中医康复科）

译者介绍

姓名：孙亚男 硕士研究生

职称：中医康复科 主治医师

擅长：针灸治疗脑卒中后遗症（睡眠障碍、吞咽障碍等）、脊髓损伤后遗症、骨关节疾病、针灸减肥等

现任：中国针灸学会会员；上海市针灸学会会员；上海市针灸学会保健康复专业委员会委员；上海市针灸学会戒烟分会委员

主持课题：2017年杨浦区中医专项科研课题“调督安神针刺治疗脑梗后睡眠障碍的临床疗效评价”（项目编号：YP17ZQ3）

发表文章：“电针结合Turgernmud系统治疗腰椎间盘突出症的临床疗效分析”上海针灸杂志，2016.6