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我国结核病(Tuberculosis,TB)疫情十分严重,是全球30个结核病高负担国家之一,结核病患者数量位居全球第二位1-2。因受新冠肺炎疫情影响,WHO调整了2020年结核病疫情估算方法3,估算有82.2万人新发结核病,3.2万人死亡。同时,准广泛耐药患者数量合计17528例。然而,现代药物的研制滞后,不能完全解决肺结核治疗面临的困难。且化学合成药物开发周期长、难度大。因此,天然药物尤其是我国中草药的研发越来越受到重视和青睐,本文就抗结核中药活性成分研究概况作综述如下。
1.0青蒿素
张宁等4通过琥珀酸将精氨酸链接到青蒿素分子上,并利用精氨酸对细菌细胞壁的扰乱作用,增强了细菌对精氨酸所携带青蒿素的摄取。体外抗结核菌实验表明,目标化合物A-2和A-3最低抑菌浓度(MIC)分别为20和10μg·mL-1,相对青蒿素提高了5-10倍。其作用强于100μg·mL-1青蒿素(P<0.05)。Fu-Wei Zhou等5逐步设计并合成了12种新型双氢青蒿素-氟喹诺酮(DHA-FQ)结合物(3种分子)。5个化合物对结核分枝杆菌H37Rv均有抑制作用,其中化合物3a的抑菌活性最强(MIC=0.0625 lg/mL),与阳性对照药物莫西沙星相当,甚至强于氧氟沙星。结合物2a和3a对各种临床分离的结核分枝杆菌敏感株和耐药株(最低抑菌浓度为0.125-16lg/mL)也显示出与莫西沙星相似的活性。所有目标化合物都具有选择性抗肺结核能力。
詹能勇等6研究青蒿提取物二氢青蒿素或青蒿琥酯抗耐药结核分枝杆菌的作用,采用液体培养基,以刃天青显色法进行判定,结果显示该中药提取物单独使用时无杀菌作用,但联合利福平或者异烟肼时,可以使利福平、异烟肼耐药结核分枝杆菌变为敏感,且青蒿琥酯比二氢青蒿素的敏感率高。
2.0黄芩苷
邵世峰等7通过配置不同浓度梯度的含黄芩苷培养基,将结核分枝杆菌菌悬液接种该含药培养基,37℃温箱孵育4周,观察其抑菌浓度(MIC)最低为1.5g/L,最高>48g/L,全敏感菌株在MIC为6g/L时数量比例最大,随着MIC值向两侧递减。提示黄芩苷在体外有抑菌作用。在结核杆菌感染过程中,TLR2和MyD88发挥着关键的作用8-9。吴燕燕等10研究表明黄芩苷能够上调TLR2蛋白和MyD88 mRNA表达,黄芩苷抗结核治疗机制可能与此相关。
3.0 狼毒
赵奎君等11采用改良罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基上生长良好的强毒人型结核杆菌(H37Rv)为试验菌,观察狼毒类中药乙醇提取物对结核杆菌的作用,结果显示,其乙醇提取物在1/100稀释度下均有一定的抑菌作用,其中以狼毒大戟的抑菌作用最强,MIC为1/3200;月腺大戟亦呈现较好的抑菌作用,MIC为1/400;但瑞香狼毒抑菌作用不明显。赵奎君等12进一步研究狼毒大戟,从其根部的乙酸乙酯提取物中分离得到了狼毒乙素(2,4 -dihydroxy-6-methoxy-3-methy lacetophenone,3)、狼毒乙素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methylacetophenone- 4-O-β-D-glucopyranoside,4)、大黄素甲醚(5)、没食子酸(6)等4个成分,并对这4个组分分别进行了抗耐药型、非耐药型结核分枝杆菌的体外活性实验。结果显示,在抑制非耐药型结核分枝杆菌方面,狼毒乙素、狼毒乙素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黄素甲醚和没食子酸分别在0.1、0.8、0.4和1.6mg/mL浓度时,明显抑制非耐药结核分枝杆菌的生长,其中,狼毒乙素的作用相对最为显著;在抑制耐药型结核分枝杆菌方面,狼毒乙素的活性也最为显著,其在0.8、1.6mg/mL两个浓度下均能显著抑制耐药结核分枝杆菌的复制;没食子酸在1.6mg/mL下也有显著的抑菌作用。陆军等13研究中药狼毒提取物对MDR-TB感染小鼠细胞免疫的调节作用,结果显示,狼毒提取物组与模型组相比TNF-γ、IL-12含量明显上升,IL-4、IL-10 水平显著下降,mRNA水平研究单个核细胞中TNF-γ、IL-12颗粒裂解肽(GLS)含量明显上升,IL-4、IL-10mRNA表达明显下降。提示狼毒提取物具有明显的抗结核和免疫调节作用。
4.0 白头翁
王淑英等14用正丁醇萃取白头翁提取物,配置浓度为60%(6 g/10 ml浸膏,相当于生药188.28g/10 ml)。试验中所用培养基分别为:空白对照组;阳性对照组(利福平5 mg/ml);含不同浓度白头翁提取物(V/V制成1∶10,1∶20,1∶40,1∶80,1∶160),结核分枝杆菌培养基(实验组)15-16。各组培养基每试管10 ml,摆斜面。新鲜的人型结核分枝杆菌标准菌株(H37Rv)、多药耐药菌株(INH/R,SM/R,RFP/R,EMB/R)、速生菌(培养12d就有菌生长)为本室(结核病研究所)保储菌株。通过观察白头翁提取物对标准菌株、多药耐药菌株以及速生菌株的影响,发现白头翁提取物(1∶10、1∶20V/V)40d内无结核标准菌株和速生菌株生长;药物组在1∶10时40d内无多药耐药菌株生长。恢复培养实验显示药物组1∶10时40 d无结核菌生长。而且不能通过恢复培养而逆转。据此初步推测白头翁正丁醇提取物中有抗结核分枝杆菌作用。
5.0大蒜
早在1942年17,苏联学者发现大蒜挥发气有抑制BCG亚种结核杆菌的作用,另外一位苏联学者用马铃薯液体培养基证明大蒜汁在1:5000-1:10,000浓度时抑制人型及牛型结核杆菌。从中国的结果看,在修改的都氏培养基中,冬季大蒜汁在1:1000对H37Rv人型杆菌有作用,而夏季时须在1:100时有效。血清能降低其作用。苏联学者17用大蒜植物杀菌素做动物实验时,发现它仅具抑制结核的作用,但不能防止感染。汪仲元18则发表了不同的看法,临床上采用大蒜、黄连素液治疗结核病,特别是气管滴入治疗肺空洞,获得良好效果。他认为,苏联学者与国内学者报道数据差别甚大。他的研究结论是,夏季红皮大蒜制菌浓度为1:300,白皮大蒜制菌力较低,为1:100。
刘金伟等19研究大蒜素对结核分枝杆菌体外抑制作用,取大蒜素片(新疆天山制药工业有限公司提供)2片(每片350mg)置无菌试管内加入1ml二甲酰胺溶解静置过夜后加入9ml无菌蒸馏水充分混匀。在4瓶100ml土豆汤琼脂培养基中分别加入大蒜素浸取液0.8ml、0.4ml、0.2ml和0.04ml后分装斜面20。其培养基中大蒜素含量分别为560μg/ml、280μg/ml、140μg/ml和28μg/ml。未加大蒜素浸取液的土豆汤琼脂斜面做对照。菌株取人型标准株、牛型标准株和临床分离结核菌10株分别接种土豆汤琼脂培养基平面、36℃孵育3周后取出,分别制成0.01mg/ml湿菌的接种液,然后各取0.1ml接种于对照和含药培养基上。36℃培养,每周观察2次。结果显示,大蒜素浓度≥140μg/mL时,结核 分枝杆菌生长时间延长,大蒜素含量≥560μg /mL 时,90% 以上结核杆菌被杀死; ≥280μg /mL 时,可杀死部分结核杆菌。特别是当大蒜素含量>140μg/ml时,这种差异非常显著(P<0.01.)
赵春燕等21通过进一步研究,发现大蒜素通过抑制PI3K/Akt通路保护结核分枝杆菌感染小鼠模型免疫功能。据报道,结核分枝杆菌通过激活PI3K/Akt信号通路诱导促炎细胞因子的产生22;激活 PI3K/Akt信号通路可导致结核分枝杆菌感染肺泡Ⅱ型细胞过度免疫反应,从而导致炎症发展23为了验证ALC可能通过抑制PI3K/Akt通路发挥对肺结核小鼠的保护作用。本研究在高剂量ALC处理的基础上再加PI3K激活剂740Y-P干预PTB小鼠,结果显示,740Y-P减弱了高剂量ALC对PTB小鼠的保护作用。证实了ALC可能通过抑制PI3K/Akt通路发挥对PTB小鼠的保护作用。
6.0 黄连
汪仲元18发现黄连素1∶4000浓度对结核菌有抑制作用,采用人型结核杆菌标准株或BCG疫苗株;匡铁吉等24则采用北京市结核病防治所中心检验室提供的结核菌标准株H37RV、H37Ra和BCG及解放军309医院提供的60株临床分离结核菌,结果发现,对结核菌标准株,较高浓度(100μg/ml)黄连素与结核菌作用一定时间,可杀死除个别抗性结核菌外的所有细菌;中浓度(60μg/ml)黄连素则可抑制大多数结核菌的生长并可杀死部分敏感细菌;低浓度黄连素30μg/ml只对结核菌早期生长有弱抑制作用;而微量黄连素(3μg/ml)对结核菌的生长反而有一定的促进作用。值得注意的是,100μg/ml黄连素作用24h,尚有高达30%~50%的菌细胞生存下来,并能以正常速度生长。故而作者有此结论,黄连素用于结核病治疗的首要问题是确保体内黄连素达到有效作用浓度,并能维持在抑菌浓度以上足够长时间。陈稚等25则考察了黄连素抗结核影响因素,发现黄连素在浓度为15mg/L,抗菌时间24小时,热处理温度为40℃,pH为5.0时,此时黄连素以季铵盐形式存在,抗菌率达到99.42%。
7.0猫爪草
临床研究表明,猫爪草抗结核效果显著。詹莉等26研究发现,Tern(猫爪草单一成分,小毛茛内酯)对休眠菌感染显示出抗菌作用,有希望作为内源性抗生素的诱导剂,治疗耐药、多耐药结核。张振凌,吴筱菁等27研究发现,猫爪草多糖、皂苷可显著升高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,促溶血素的形成并提高外周血T淋巴细胞数,有免疫兴奋作用。比较而言,猫爪草多糖比皂苷更胜一筹。谢建平等28将猫爪草75%乙醇浸提物浓缩后,每ml相当于5g生药,处理终浓度为每ml相当于1g生药浓度。将浓缩提取物加入培养至对数期的结核菌培养基中,处理30 min后进行后续蛋白质电泳、抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)和凋亡等分析,对猫爪草提取物作用前后的结核分支杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析,发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对其中4个表达明显下调蛋白的质斑点进行分析鉴定,获得4个明确的肽质量指纹图谱。通过数据库检索,确定这四个蛋白质分别为 S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)、吲哚-3-甘油磷酸合酶(IGPS)、烯酰-CoA水合酶和琥珀酰辅酶A合成酶。熊友谊等29以猫爪草的石油醚提取有效部位,发现猫爪草石油醚提取物能够显著抑制多药耐药结核菌株细胞外、细胞内的生长,并增加感染的巨噬细胞TNF-α的表达水平。熊英等30通过波普技术,根据药敏试验,发现2-脱氧-D-核糖 酸-1,4-内酯(1)、异麦芽酚-α-D-葡萄糖苷(2)、香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷(3)、水杨苷(4) 3,4-二甲氧基苯甲酸(6)、咖啡酸(7)具有抗耐药结核活性。高英兰31通过猫爪草有效成分的提取及其分散片的研制,发现猫爪草的最佳乙醇提取工艺为:将猫爪草药材用75%乙醇回流提取2次,每次提取2小时;猫爪草的最佳多糖提取工艺为:将猫爪草药材用12倍量水煎煮3次,每次煎煮3小时;粗多糖的最佳精制工艺为:采用截留分子量为60kD和20kD的 膜进行分离,在20~30℃、0.10~0.15MPa条件下进行超滤;猫爪草分散片的制剂成型工艺为:填充剂为微晶纤维素,崩解剂为PVPP:LS-HPC(2:1)并采用PVPP与SDS内加、LS-HPC外加的方式加入,润滑剂为微粉硅胶,最佳片重为1.0g,即得分散片成品;确定了本品的外观性状为浅黄棕色片剂,气微香。分散片硬度适中,崩解时限小于3分钟。猫爪草分散片加速稳定性试验和长期稳定性试验的各项考察指标都符合规定。
8.0苦参
付海根等32以苦参碱为起始原料,最终合成12N-正十二烷基苦参丁甲酯。初步的体外生物活性测试结果表明,该化学成分具有较佳的抗结核活性,对敏感结核菌株H37Rv的MIC为8.0μg/mL。
9.0 葎草
郭沛琳等33采用系统溶剂法分离葎草中不同极性的提取部位,用直接浸泡法观察其对结核杆菌标准菌株H37Rv的抗菌作用,并采用试管倍比稀释法测定葎草不同极性提取部位的最低抗菌浓度。发现葎草乙酸乙酯部位对结核杆菌标准菌株H37Rv有较明显的抗菌作用,其最低抗菌浓度为31.2mg/mL。
10.0 水车前
李华安等34用水车前的水煎浸膏外敷,治疗两例对利福平和异烟肼都不敏感的颈淋巴结核,3个月内均获痊愈。通过实验发现,水车前的水煎浸膏对人体病灶分离培养的结核杆菌有较强的抑制作用或杀灭作用。其在培养基中对人体病灶结核杆菌的抑制或杀灭作用的强弱与药物浓度成正比,在含药量为1:10至1:10000之间都有效。
11.0 蛇床子
蛇床子素即是甲基欧芹酚,主要是由果实中提出的一种香豆素。曾范利35通过过MABA和试管法,测定蛇床子素对结核分枝杆菌的菌侏H37Rv和H37Ra的体外抗菌活性,其结果表明,蛇床子素对这两种菌株的MIC均为32μg/mL。王静芳36通过实验,发现蛇床子主要是通过干扰细菌蛋白质合成来实现杀结核分枝杆菌的作用,且临床实验中表明蛇床子是不易产生耐药性的。
12.0 金银花
邱葵等37采用结核分枝杆菌标准株和金色分枝杆菌对金银花提取物进行了初步研究。在体外药敏试验中,金银花提取物与异烟肼配伍使用时显著降低异烟肼对分枝杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),而且金银花成分绿原酸有利胆保肝作用。但是作者认为,不足之处是,金银花提纯物中杂质较多,需要分离纯化;另外,绿原酸的抗结核分枝杆菌活性不及异烟肼。范君文等38通过MABA药敏试验方法发现金银花的乙醇提取物对结核分枝杆菌菌株H37Rv的MIC为50μg/ml,而水提取物>200μg/ml。说明乙醇提取物抑菌效果更好。
13.0 巴豆
蜡巴豆丸在临床可以用来治疗骨结核、肺结核等。赵中夫等39观察巴豆油体外对结核杆菌的生长抑制作用,发现各浓度巴豆油组(1:10~1:5120)均对结核菌生长有抑制作用。其中,1:10~1:160组到培养终止期(40d)仍无细菌生长。巴豆油1∶160组的抗菌效果与含链霉素(100μg/mL)培养基基本相似。提示巴豆油有体外抗结核菌的作用,一定浓度的巴豆油对结核菌有不可恢复的杀灭作用。
14.0 大蓟
万成杰等40采用活性跟踪分离方法,从大蓟根中分离得到具有抗结核杆菌活性的化合物HP01,鉴定为槲皮素。槲皮素抑制结核杆菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值为160 μg/mL。槲皮素与吡嗪酰胺存在相加作用,与异烟肼、利福平无拮抗作用。分子对接显示,槲皮素与KatG酶具有较强的亲和力。酶活力测试结果表明槲皮素对结核杆菌KatG酶具有抑制作用,并导致结核杆菌结构破坏,从而杀死结核杆菌。范君文等41对29种中药提取物进行筛选,发现大蓟的醇提取物最低抑菌浓度≤200μg/ml,具有显著抗结核活性。
15.0 补骨脂和山竹子
赵全民等42分别从藤黄科藤黄属植物山竹子中提取单体化合物α-倒捻子素和补骨脂中提取8-甲氧基补骨脂素,研究发现,前者对H37Rv和H37Ra株最低抑菌浓度为6.25μg/ml,后者为128μg/ml。
16.0 天南星
谢宗会43采用活性跟踪分离法,从天南星中跟踪分离得到具有抗结核杆菌活性的化合物SF,根据波谱数据结合文献,该化合物被鉴定为水飞蓟宾。采用刃天青显色法,测得水飞蓟宾抑制结核杆菌的MIC值为160μg/ml。
17.0 壁虎
壁虎的临床应用在结核病方面主要体现在肺结核、脊柱结核、胸腰椎结核、淋巴结核、颈淋巴结核或肿大以及骨与关节结核(骨痨),但现代文献关于其单体的研究不多,康建功博士44通过提取鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分纳米脂质体,发现抗肿瘤活性显著,可能通过调节体内的TNF-α,抑制肿瘤生长而发挥抗癌作用。Keane45认为,TNF-α通过诱导巨噬细胞凋亡来增强巨噬细胞杀灭结核分枝杆菌。因此,壁虎活性成分纳米脂质体可能具有抗结核疗效。康健功46进一步采用旋转薄膜分散超声法制备脂质体包封率较高,且稳定性比较好。尹慧萍等47从壁虎中提取出壁虎粗多肽,研究发现,它首先使Caspase-3和Caspase-9的表达显著上调,激活线粒体凋亡的信号通路,诱使人神经母细胞瘤细胞出现凋亡,进而抑制肿瘤细胞的增殖和扩散。而结核病细胞凋亡可通过激活caspase来介导48。
18.0 甘草
孙瑾霞49利用结核菌感染的巨噬细胞和PBMC体外肉芽肿模型,对异甘草素的炎症调控作用进行了综合评价,结果表明,异甘草素能通过Notch1/Akt/NF-κB轴和MAPK中JNK、ERK通路抑制结核分枝杆菌感染巨噬细胞NLRP3炎性小体的活化,抑制IL-1β的分泌,并下调TNF-α、IL-6、iNOS、COX2 和HMGB1等炎症因子的表达;通过对巨噬细胞炎症因子的调控,改变肉芽肿内微环境,抑制了肉芽肿内Th1和Th17亚群的分化,促进Th2和Treg亚群的分化;最终改善了Th1/Th2、Th17/Treg的亚群失衡。
19.0 黄芪
XuHD等50体外培养小鼠巨噬细胞,用黄芪多糖和黄芪皂苷干预治疗后,采用实时定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的含量,以评价巨噬细胞的吞噬活性,发现巨噬细胞释放的细胞因子可显著增加。
鉴于有些中草药抗结核活性成分不足,如夏枯草、丹参、远志、百部等,本文没有纳入;有些中草药因为没有相关单体或活性成分的研究,也没有纳入,如三七、五味子、骨碎补、生地黄、百合、蜘蛛、炮山甲、阿胶等。还有些药物,如黄柏与黄连都含有小檗碱,且黄连含量相对较高,所有黄柏没有纳入。综上所述,如果能从上述单体中筛选出杀菌和免疫中最强者,可能给我国抗结核或耐药结核的治疗迎来新的曙光。
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