章奇，吴俊，叶冬青，范引光. 病因推断的远征者：罗伯特·科赫. 中华疾病控制杂志，2020,24（10）：1237-1240

【摘要】19 世纪的德国医生罗伯特·科赫（Ｒobert Koch，1843-1910）是世界病原细菌学的奠基人和开拓者，也是流行病学病因推断的远征者。他开创了结核杆菌染色、固体培养基、显微摄影术以及细菌显微镜术等，奠定了微生物学的基础； 他先后发现炭疽杆菌、伤寒杆菌、结核杆菌和霍乱弧菌等百余种细菌，拨开了未知病因疾病的神秘面纱； 单病因生物特异病因学说和科赫法则的面世，开启了病因推断的“黄金时代”。

1843年 12 月 11 日，罗伯特·科赫（obert Koch，1843―1910）在德国汉诺威州哈尔茨山区克劳塞尔村一个矿山工程师家庭出生。科赫从小就显示出超凡的智慧和毅力，5 岁的他就通过报纸自学了阅读。同时，他还对大自然怀有好奇心，经常到山间采集生物和矿石，带回家用放大镜仔细观察。在高中读书时，他表现出对微生物学的浓厚兴趣。在哥廷根大学读书期间，科赫成为了德国病理学家、解剖学家和组织学先驱亨勒（Friedrich Gustav Jakob Henle，1809―1885）教授的学生。亨勒认为少量进入人体的物质能引起大量的生物反应，这些物质肯定能在人体内生长、繁殖，以此推测传染源可能是活的生物。科赫受老师影响，对“传染说”深信不疑，并积极寻找证据证明“活的传染源”假说。1866 年，科赫大学毕业后留在柏林学习，期间受到了鲁道夫·魏尔肖（Ｒudolf Virchow，1821―1902）提出的细胞病原学观点影响，即所有细胞都来源于先前存在细胞。于是，科赫尝试从细胞水平解释“活的传染源”。1870―1871年普法战争爆发，科赫入伍担任军医。在这次战役里，他被战争和受病痛折磨的人民群众所深深震撼，心中激荡起强烈的民族情怀。

退伍后，他便潜心研究疫病的病因。1870年退伍后，科赫在饱受炭疽病摧残的沃尔施泰因（Wollstein） 任职医疗官员。他的第二任妻子为了支持他的实验研究，在他的生日当天送给他一台显微镜。

利用这台显微镜，科赫开始观察微观世界里炭疽病的物质变化。1876 年，科赫在艰难的实验条件下证明炭疽杆菌是炭疽病发病的病因。1878―1880年，他掌握了用不同染液给细菌染色的技术，为今后重大的科学发现奠定了基础； 他首创细菌显微摄影术，消除以往因肉眼观察、文字描述或手绘图象而引起的种种争议和混乱，使摄影因“结果可视化”成为一种科学方法被医学界采纳； 他还利用显微镜特殊照明装置和油浸镜头，找出引起化脓的是以链球菌和葡萄球菌为主的各种细菌。随后，科赫把注意力放到了当时肆虐的结核病上。1882年3 月 24 日他在德国柏林生理学会上宣布结核杆菌是结核病的病原菌，与会者纷纷批评他并对他的发现提出异议。

尽管这样，这一天也成了人类医学史上的一个重要里程碑，科赫的经典著作《结核病病原学》也于当年问世。科赫发现结核杆菌对扭转流行病危害人类生命产生了重要影响。

1883 年科赫被派往埃及和印度等地调查当地霍乱流行情况，发现了霍乱的病原菌是“形如逗号”的霍乱弧菌，并于1884年提出控制霍乱流行的法则。这些法则于1893年被各个国家批准实施，并形成至今仍被沿用的霍乱控制方法基础。1890年，他发现了能够遏制结核病的结核菌素，使笼罩人类健康的“结核病”雾霾就此散去。1905年，他发表了如何控制结核病的论文，并获得诺贝尔生理学和医学奖。

科赫的一生都在与质疑作斗争，无论是创新细菌学科研技术，还是解开未知病因疾病的神秘面纱，在解除人类之病痛的道路上，科赫从未停下他的脚步。科赫曾在关于结核病的文章中道出了他的终生目标： “我对公共卫生的利益进行了调查，并希望由此产生最大的收益”。科赫对公共卫生的巨大贡献使其被后人尊为“细菌学之父”，也开启了流行病学病因推断的“黄金时代”。

1 开创临床试验

古罗马诗人维吉尔（Virgil，公元前70―19）在其著作《农事诗》中曾描述过动物短时间内死亡的场景。1837 年，随着纺织业的发展，有些剪毛工人身上开始出现黑色的焦痂，并在数天内死亡。从这时开始，炭疽病在人群中悄然流行开来。1849 年法国医生达韦纳（Casimir Joseph Davaine，1812―1882）借用显微镜首先对病羊血液中的“短棒状，大小约红细胞一半”的竹节状结构进行描述。1860年，达韦纳受到法国微生物学家巴斯德（Louis Pasteur，1822―1895）启发进行了动物实验，提出竹节状结构可能是炭疽热的病因。这些结果虽缺乏确凿性证据，但却为科赫将病原微生物与疾病联系起来创造了前提。1870年，科赫在德国东普鲁士的一个美丽小镇沃尔施泰因担任医疗官员。在任职期间，炭疽造成 528人和 56 000头牲畜死亡，严重影响到人们的生活和生产，医学界却对其知之甚少。为了遏制炭疽的危害，科赫开始用动物做实验。他发现用死于炭疽的绵羊血液接种老鼠，老鼠第二天就会死亡。尸检时，老鼠的血液、淋巴结和脾脏中都带有杆状生物。第一只患病小鼠的脾血接种第二只小鼠也出现同样的结果。通过相同重复的接种，科赫发现这些血液里的竹节状结构生物长度各不相同且常有凹痕。于是，科赫假设它们都是活菌，并且通过伸长和分裂繁殖。这种杆状细菌是疾病传播所必需的，可是携带细菌的血液在离开机体几天后就失去了致病力，这与之前发现土壤长期毒性存在冲突。

为了继续进行研究，科赫创新性地将充满在眼前后房内由睫状体突产生的透明清澈液体——房水作为“培养”细菌的媒介，并通过极其精细的显微镜技术，观察细菌随时间的变化情况。他把一块受炭疽感染的脾脏组织放在一滴房水里并密封，创造了细菌的“生活”环境。然后，他使用石油灯、潮湿的室内、培养箱和植物油控制实验的温度、湿度和通风。通过长期地观察，他发现在最佳条件下（温暖、潮湿和通气），细菌会膨胀、拉长并形成长丝。细丝产生颗粒，然后发展成可折射的球体。科赫假设这些球体是孢子，它们是在恶劣环境中出现的弹性结构。在没有细菌的情况下，这些孢子可以引起炭疽病。孢子的出现解释了土壤的长期毒性。当发现孢子在疾病发病中的重要性后，科赫建议将患病的动物焚烧或埋在足够冷的土壤中以防止孢子形成。科赫对于炭疽杆菌的研究不仅控制了炭疽病的蔓延，也促使细菌学迎来蓬勃发展的时代。

炭疽杆菌研究结束之后，科赫将注意力转向了结核病。在科赫之前，结核病的传播模式已存在很多猜测。例如，希波克拉底（Hippocrates，公元前 460―370）认为肺结核是遗传性的；盖伦（Claudius Galenus，131―201）是第一个认为结核病可以传播的人；弗朗卡斯托罗（ Girolamo Francastoro，1483―1553）认为一些疾病可以通过人类直接或间接接触“粒子”而传播；本杰明·马滕（Benjamin Marten，1690―1752）等人支持结核病可能是由可能导致疾病损害的极其微小的生物引起的，提出“传染性活液”理论。显微镜学家列文虎克（Antony van Leeuwenhoek，1632―1723）在 1676年的报告中提出发现了细菌，但并不认为它可以致病。直至 19 世纪上半叶，欧洲才逐渐兴起细菌理论。科赫立足于前人研究，尝试解开结核病病原体的秘密。细菌染色技术是科赫团队的第一个创新，他观察到使用酒精亚甲基蓝染色法（卡尔·魏格特，Karl Weigert，1875年发明）不易让结核性病变组织染色，只有在与亚甲基蓝接触 24 h 后，再与氢氧化钾接触，组织才能被染色，最后再被苯胺棕复染。当在 40℃下加热制备物时，亚甲基蓝染色所需时间将缩短至 1 h。利用这种染色法，科赫给结核病菌染上了蓝色，动物组织结构和其他细菌染上了棕色。棕色组织和蓝色结核菌之间的对比使其更易被显微镜检测到。保罗·埃利希（Paul Ehrlich，1854―1915）和科赫进一步修改了染色方案。科赫利用这种新染色方法发现结核菌是一种以杆状细菌形式存在的生物，并且无论是在胞内还是胞外，结核杆菌都是在病变组织内分组出现的。这虽然并不能证明这种生物是结核病的病原，却使科赫更加坚信结核病的微生物假说。固体培养基的发明是科赫第二项创新。他采用凝固的牛或羊血清，通过丁达尔先前报道的程序，即58℃下重复、短时间加热以及消毒，在65℃下长时间加热将介质融化，之后将其倒入倾斜管以增加接种面积。接种后，试管在 37～38℃下孵育，肉眼检测生长菌落。科赫通过对实验感染的豚鼠肺组织进行接种进行初步实验，10～14 d后观察菌落。他采用 309～409倍的放大倍数检测菌落生长情况，第一周结束前即检测到了菌落。科赫共从 4 只实验感染的豚鼠、4 只患结核病的牛和 7 名患者身上获得 15 种纯种结核杆菌培养物。这一伟大的发现使科赫获得了1905年诺贝尔医学奖。

先天下之忧而忧。科赫在艰难环境中发现了杆菌－芽孢－杆菌循环的炭疽杆菌生活史。他发现结核杆菌能通过空气传播，驱散了笼罩在公共健康上的“结核病”阴霾。他的工作为之后病因学、传染病学和微生物学的研究铺平了道路。

2 病因推断

在科赫没有发现炭疽杆菌之前，人们对疾病的产生存在各种猜测。最初的病因论是疾病是上帝或鬼神对世人惩罚等唯心主义观点。我国祖先将疾病的发生归因于金、木、水、火和土等外界物质，创建了古代朴素的唯物主义病因观。公元前 1 世纪，瓦罗（Varro）在其论著《论农业》中写道：“潮湿的地方生长着微小生物，它们非常小，我们看不到。它们会通过口和鼻进入人体，并引发严重疾病”，人们开始意识到微小有机生命体可以对流行病传播起到某种作用。16世纪末，显微镜出现将人类带入一个更加微观的世界，人们第一次发现自然界无处不在的微生物。微生物学的发展使病因论进入新的历史进程。

1876 年，科赫证明炭疽杆菌是炭疽病发病的病因，第一次证明一种特定细菌是引起一种特定传染病的病因，并提出单病因生物特异病因学说。科赫认为，某些动物和人的疾病是由微生物感染所引起的，不同微生物可导致不同疾病。

科赫又陆续发现了链球菌、伤寒杆菌和结核杆菌等其它细菌，他分离和确认传染病病原体的技术越发成熟。科赫对其他疾病病原体进行检验时，国内和国际开始热烈争论霍乱性质。霍乱究竟是直接或间接地通过人与人之间的接触传播，还是“纯粹的流行病”，人们对此始终有很大分歧。1883 年，科赫担任德国特派团团长时，他开始对霍乱进行细菌学调查，对死于霍乱的病人进行尸检。报告显示，霍乱的病人大便中含有多种有机体，没有优势种，但死于霍乱而非其他腹泻疾病患者的肠粘膜中持续存在一种特定的芽孢杆菌。科赫认为，这种芽孢杆菌与霍乱之间可能存在某种联系，但要确定因果关系还为之过早。他认为必须分离出细菌且能培养出纯种芽孢杆菌，并将细菌接种到动物身上使其感染霍乱时，才能判断这种细菌是霍乱病因。为了证实自己的猜想，科赫启程来到埃及亚历山大港。抵达之前，法国政府驻扎在此地的医疗团队已调查了九天，也发现了这种可疑的芽孢杆菌。科赫在埃及研究了近三个月，却没能解开霍乱秘密。第二年报告中，他解释不能简单的将结果认定为“在大多数病例中数量最多的微生物”，但他发现血液中有一种与霍乱有某种因果关系的小体，该小体被科赫证实为血小板。

离开埃及后，科赫团队到达加尔各答开展进一步的研究，首先是进行尸检和微生物观察，并将结果与埃及情况进行比较；其次，尝试在纯培养物中培养特征性芽孢杆菌，并在动物中进行实验性感染；除此之外还对流行地区土壤、水和空气以及种群及其环境的任何特殊特征进行调查。1884年，科赫宣布已经成功分离和培养了纯种芽孢杆菌。他认为，虽然这种杆菌无法导致动物产生同样疾病，但即使是仅在霍乱病人体内发现，那么它与霍乱之间的因果关系也毋庸置疑。科赫指出这种杆菌形状“有点弯曲，像逗号”，在潮湿的亚麻布或潮湿的土壤中具有增殖能力，对干燥和弱酸溶液有显著敏感性。霍乱患者体内总能发现这种特定微生物，而其他原因引起的腹泻患者中却没有。霍乱早期，它们相对很少见，随着病情逐渐发展，该细菌以绝对优势种存在。康复患者中，细菌又逐渐从粪便中消失。事实证明，这种细菌不能在动物中引发霍乱。基于长期的工作经验和对研究成果的总结，在借鉴他人成就的基础上，科赫于1884 年发表了著名的科赫法则：（1）每位患者体内都可以通过纯培养技术分离到疾病病原体；（2）其他疾病患者中没有发现疾病病原体；（3）疾病病原体能在实验动物中引发同样疾病；（4）被实验感染的动物中也能分离到疾病病原体。科赫法则作为一种先进的研究思路，是验证病原体与疾病之间联系时遵循的法则，指导着流行病病因学探索。

流行病学是研究者通过获取未知疾病病因线索，控制病因链中关键环节和薄弱环节，达到预防、控制和消灭疾病及促进健康的目的。病因推断对流行病学至关重要，是现代医学科研中探究人群流行病影响因素的主要任务之一。在未知病因的流行病暴发时，流行病学家的主要任务是通过寻找病因和传播途径来控制疫情，此时科赫所提出的病原体判断方法显得尤为重要。流行病学家通过科赫法则等方法快速确认病原体和传播途径，对控制疫情的蔓延和临床医生对症下药救治病人起到决定性作用。

现代医学认为影响人类健康的因素是多样的，包括宿主因素和生物、化学、物理以及社会等环境因素，并不单纯局限于微生物。流行病的表现形式也包括长期变动和短期波动。科赫法则虽然有其局限性，但它表达出来的思维逻辑仍可被吸收利用。例如，对于某些慢性病可能并非由某种微生物病原体引起，但可以引申为该患者人群中共有的某种特征或行为，与非该病患者人群无统计学关联，但当该特征或行为出现在一般人群中将会导致患病率升高。因此，科赫法则对认识流行病病因以及疾病防控有着非凡意义。

科赫先发现炭疽杆菌，提出单病因生物特异病因学说。为了证实炭疽真正病因，他先后出国考察7 次，提出了科赫法则，使以研究传染病为主的流行病学得到了长足发展。他为探求真理坚持不懈，是一名真正的远征者。科赫法则虽然具有一定局限性，但至今仍是新发传染病特异性致病微生物病因推断的主要原则，它所含有的思维逻辑依旧闪烁在流行病学历史长河中。

“永不虚度年华”是科赫的座右铭，他的一生都在践行这句话。从证明一种特定细菌是引起一种特定传染病病因的炭疽杆菌，再到分离结核杆菌、发明结核菌素，他驱散了笼罩在人类健康上的阴霾。从创新细菌染色技术、发展固体培养基到发表科赫法则，科赫开启了病原细菌学和流行病学的新领域。为探索流行病的病因，解除人类病痛，他从未停歇下脚步。有人比喻科赫： “是微观世界里涌现的一颗巨星”。公共卫生和预防医学工作者将永远铭记这位流行病学病因推断的远征者，学习他不断探索病因、执着追求的精神。

参考文献（略）