（五）病毒学的诞生

从细菌学到病毒学，是人类对病原体认识的又一次跨越。当我们回顾第一种病毒发现的历史，就深深地理解：这个跨越也意味着对既往理论、方法和技术的突破的艰辛。

其实，每一种病毒的发现都有其“柳暗花明”的曲折过程。限于篇幅，本书仅仅简述烟草花叶病毒的发现历程，因为它既具有激动人心的创新历程，又呈现出病毒学诞生的总体轮廓，至于整个病毒学的发展历程，就不做详细的介绍了。

这里，主要参考中国科协-北京大学（联合）科学文化研究院副院长，北京大学医学人文学院院长周程教授的文章——“病毒是什么”（原文刊于《工程研究-跨学科视野中的工程》2020年第1期），让我们来看看病毒学诞生的曲折经历。

1. 麦尔：烟草花叶病是一种植物传染病

因率先成功制备烟草花叶病毒蛋白质结晶而分享1946年诺贝尔化学奖的美国生物化学家斯坦利（Wendell Meredith Stanley，1904-1971），在1944年发表的一篇文章中指出：有相当多的理由将俄国的植物生理学家伊万诺夫斯基（Dmitri Ivanovsky， 1864-1920）视作新兴的病毒学学科之父。

但是，讨论首个病毒的发现经过时，我们不能不从德国农业化学家麦尔（Adolf Eduard Mayer，1843-1942，图6-31）说起。

图6-31  麦尔（Adolf Eduard Mayer，1843–1942） 

麦尔在海德堡大学讲授一段时间的发酵学和化学工程之后，于1876年赴荷兰担任瓦格宁根农业试验站主任。当时，很多种植烟草的农民都遇到了一个困惑，即烟草长出的深绿叶子上会莫名其妙地出现浅绿色斑纹，导致烟叶产量和质量受到严重影响。

麦尔自1879年开始对烟草的种植进行观察与研究，并于1882年将这种烟草疾病命名为“烟草花叶病”（Tobacco Mosaic Disease）。麦尔曾研究过种子、气温、气候、光照、土壤等对烟草花叶病的影响，但结果都一一被排除。

那时候，人们已经开始接受科赫的“细菌致病理论”（germ theory），那么烟草花叶病会不会也是因细菌感染造成的？

麦尔决定模仿科赫的研究，他将患有花叶病的烟草叶子捣碎、将从中提取的汁液用玻璃毛细管注入多株健康烟草的叶脉中。结果发现，这些烟草已经长出的叶子并没有出现花叶病症，但大约10天后新长出来的嫩叶几乎都出现了花叶病症。而且，将从患有花叶病的烟草叶子中提取的汁液加热到摄氏80度后，这些汁液都会失去上述特性。

因此，麦尔怀疑患病烟草叶子的汁液中含有可传染花叶病的细菌，他使用当时最先进的光学显微镜进行观察用培养皿进行培养，但仍然没有找到这种“细菌”。于是，他开始给健康烟草接种各种各样的已知细菌，看看导致烟草感染花叶病的细菌是不是其中的一种。未果后，他又给健康烟草接种一些动物和人的粪肥，以及磨碎了的过期奶酪和腐败了的豆制品，看看烟草花叶病会不会是像酵母那样的真菌作用的结果，所有这些努力都未能帮助麦尔找到烟草花叶病的致病因子。

麦尔后来又做了一系列实验。他发现，用单层滤纸过滤患病烟草叶子的汁液时，致病因子是能够通过滤纸的。但他还发现，使用双层滤纸过滤时，提取液会变成“透明滤液”，而且这种滤液不具有传染性。由此，麦尔推定，烟草感染花叶病不可能是由真菌引起的，因为即使是酵母这样的微小真菌也穿越不了滤纸，也就是说它们在第一次过滤时就会被滤除。麦尔认为，烟草花叶病也不会是酶参与作用的结果，因为酶之类化学物质不仅不能自我繁殖，而且即使是使用多层滤纸过滤也不至于被滤除。

尽管如此，麦尔给出的最终结论仍然是：①烟草感染花叶病与细菌有关；②患有花叶病的烟草叶子污染土壤后容易引起花叶病，因此不能将病变烟叶放置在烟田里。

虽然麦尔并没有找到烟草花叶病的致病因子，但他1886年还是公开发表了上述研究结论。尽管这个结论并不准确，但致病因子能够通过滤纸的这一发现是非常可贵的。他的研究结果对正在撰写与烟草花叶病有关的学位论文的俄国学生伊万诺夫斯基（Dmitri Ivanovsky，1864-1920），以及当时的荷兰同行贝杰林克（Martinus Beijerinck，1851-1931）产生了很大的影响，并为他们取得突破奠定了重要基础。

2. 伊万诺夫斯基：烟草花叶病致病因子不同于一般细菌

伊万诺夫斯基在圣彼得堡大学学习期间，曾于1887年和1890年两度接受俄罗斯农业部的委托赴乌克兰和克里米亚调查烟草疾病的形成原因。伊万诺夫斯基提交的学位论文“论烟草的两种疾病”，于1888年通过审查，被圣彼得堡大学授予理学士学位。

在搜集有关烟草疾病的先行研究文献过程中，他获悉德国学者麦尔此前已对烟草花叶病展开过深入细致的研究。不过，伊万诺夫斯基在重复麦尔的实验时发现，使用两层滤纸对患有花叶病的烟草叶子的汁液进行过滤后，所获得的滤液仍然具有传染性，这与麦尔的实验结果明显不符（图6-32）。

图6-32  烟草花叶病患叶研磨过滤后的溶液喷洒健康的烟草花叶也可以使健康烟草花叶染病 

于是，他又使用一种当时最为先进的可用于生产无菌纯净水的过滤器——尚柏朗（Charles Chamberland，1851-1908）氏过滤器对患有花叶病的烟草叶子的汁液进行了过滤。结果，所获得的滤液同样具有传染性。

在伊万诺夫斯基看来，只有两种可能性可以解释这种现象：①这种过滤器存在质量问题，以致具有传染性的细菌通过了通常根本无法通过的微小滤孔；②滤液中的致病因子是一种和自己两年前发现的毒素类似的物质，这种毒素有可能是细菌在过滤过程中分泌出来的。

总而言之，在年轻的伊万诺夫斯基看来，汁液的传染性都是由细菌导致的。可见，巴斯德（Louis Pasteur，1822-1895）和科赫的细菌致病说在当时多么具有影响力。正因为如此，他未能对该项实验结果所揭示的意义进行深入的思考和探究。他虽然率先发现通过细菌过滤器的滤液仍然具有传染性这一现象，但却未能明确提出滤过性病原体这一概念。

其实，即使是在当时的实验条件下，要进一步寻找这种体度远小于常见细菌的致病因子并非完全不可能。但是，伊万诺夫斯基并没有这么做。1892年，他向圣彼得堡科学院提交了一篇题为“关于烟草花叶病”的论文，介绍了上述研究发现。因此，后来很多学者，尤其是俄国学者据此认为，伊万诺夫斯基发现了滤过性病原体，亦即病毒的发现者。

为纪念伊万诺夫斯基的上述研究业绩，前苏联《微生物学》杂志曾在1942年出了一个纪念专辑。1964年，在伊万诺夫斯基诞辰100 周年之际，前苏联还将其视作为病毒学的创始人特意为其发行了一枚纪念邮票（图6-33）。1992年，普林斯顿大学分子生物学系的卢斯蒂格（Alice Lustig）和莱文（Arnold J. Levine）在题为《病毒学100年》的评论中高度评价了伊万诺夫斯基百年前的研究，认为该项研究迈出了病毒发现的第一步。

图6-33  1964年，前苏联为伊万诺夫斯基（Dmitri Ivanovsky，1864-1920）诞辰100周年发行的纪念邮票 

但是很多欧美学者认为，虽然伊万诺夫斯基1892年发表的论文值得在病毒学史中大书特书，但将其视作为病毒的发现者未必合适。例如，1998年，英国皇家学会召开了“烟草花叶病毒：一个世纪的开创性研究”专题研讨会，该会的组织者就倾向于认为荷兰的微生物学家贝杰林克才是病毒学学科的创始人。

3. 贝杰林克：率先改造传统“病毒”概念

1876年，荷兰科学家贝杰林克（图6-34）赴新创立的瓦格宁根农业学校担任植物学教师。同年，麦尔也来到了瓦格宁根，贝杰林克从麦尔那里获得了不少有关烟草花叶病的研究信息。1885年，贝杰林克从瓦格宁根搬迁到代尔夫特，在一家生产酵母和酒精的工厂担任细菌学实验室负责人。1895年，他又来到代尔夫特理工学院担任细菌学教授。

图6-34  贝杰林克（Martinus Beijerinck，1851-1931）

1897年，新的细菌学实验室和温室一经建成，贝杰林克便急切地重新开启了烟草花叶病研究。1898年，他发表了一篇著名论文，提出了“传染性活流质（contagium vivum fluidum）”的概念。1900年，他又将这篇论文翻译成了法文，从而引起了广泛的关注。

从贝杰林克1898年发表的论文中可以看出，他和伊万诺夫斯基一样使用尚柏朗氏过滤器对从患有花叶病的烟草叶子中提取的汁液进行了过滤，并发现滤液具有传染性。不过，贝杰林克在上述论文中并没有引用伊万诺夫斯基1892年写的论文。这很可能是因为他当时的确没有看到该论文。

尚柏朗氏过滤器使用陶瓷做滤芯，即使是非常微小的细菌也无法通过陶瓷滤芯上的滤孔进入滤液（图6-35）。但贝杰林克发现，从患有花叶病的烟草叶液中提取的滤液居然有传染性：一方面，使用最先进的光学显微镜也无法从滤液中找到致病因子；另一方面，无论是在有氧的环境下，还是在无氧的环境下，对滤液进行培养后，结果都显示滤液中没有任何细菌。这种感染性来自于什么？贝杰林克没有裹足不前。

图6-35  贝杰林克研究烟草叶液使用的尚柏朗氏过滤器

贝杰林克对滤液进行大剂量稀释后做了一组对比实验，他发现大剂量稀释后的滤液和未经稀释的滤液对健康烟草产生感染的程度几乎没有差别。而且，受稀释滤液感染的烟草叶子的汁液仍然具有很强的感染性，健康烟草接种其汁液后仍然都会出现花叶病症状。于是，贝杰林克推定滤液的感染性不是由无生命的化学物质引起的。如果滤液中存在有生命的致病因子，那么这种致病因子是如何增殖的呢？

贝杰林克又做了一组对比实验。他像过滤患病烟草叶子的汁液一样，用尚柏朗氏过滤器对健康烟草叶子的汁液进行了过滤，并获得了一批滤液。他将这种滤液加入到有传染性的滤液中之后，再给健康烟草进行接种。他发现健康烟草感染后的病症表现程度与他用同体积的蒸馏水稀释后的带有传染性的滤液的情况一样。这意味着致病因子并没有在健康烟草叶子汁液的滤液中发生增殖。它表明，致病因子只有在有细胞的条件下才有可能发生增殖（6-36）。

图6-36  贝杰林克的试验记录

尽管滤液中的致病因子无法用光学显微镜观察到，但并不能排除它是比细胞还要小的超显微颗粒的可能。

于是，贝杰林克又使用琼脂凝胶层析的方法做了一组实验。他将从患病烟草叶子的汁液中提取的滤液滴到琼脂凝胶上，然后将其抹匀，并定期加注纯净水，以方便滤液扩散。贝杰林克认为，如果滤液中的致病因子具有可溶性，那它就会渗透到琼脂凝胶内部；如果致病因子具有颗粒性，那它就不会扩散。结果显示，滤液10日后能够向琼脂凝胶内部至少扩散2毫米。而且，扩散至琼脂凝胶内部的滤液仍然具有传染性。贝杰林克据此推定，烟草花叶病的致病因子是一种液体或者是可溶的，也就是说不是颗粒状的。

为了弄清烟草花叶病致病因子是如何感染烟草组织的，贝杰林克进行了一系列观察。他发现，健康烟草接种病变叶子汁液的滤液后，总是在新长出来的嫩叶上出现花叶病斑，已经完全成熟的烟草叶子上并不会出现花叶病斑。叶子在生长过程中，总是在叶尖部位出现花叶病斑，在叶尖下部并不会出现花叶病斑。而且，土壤中的致病因子是由根部进入烟草体内的。

因此，贝杰林克推定，致病因子先进入烟草茎部，然后再感染正在进行细胞分裂的组织——叶芽或叶尖。致病因子只会在细胞组织分裂、生长时才增殖。尽管不会在不再分裂的成熟的细胞组织中增殖，但却可以通过其传播扩散。

贝杰林克还对烟草花叶病致病因子的活性进行了深入研究。他发现，滤液保存三个月之后，其传染能力并没有出现任何变化。而且，在摄氏40度的条件下将在病叶汁液中浸泡过的滤纸烘干后，仍能使健康烟草出现花叶病症；将自然干燥后的病叶放置在植物标本箱里保存两年后，同样能使健康烟草感染花叶病。不过在这两种情况下，致病因子的感染能力都会有所减弱。此外，将病叶汁液的滤液加热到摄氏90度后，滤液将会完全失去活性，不再具有传染性。

贝杰林克还做了一项有关烟草花叶病致病因子的越冬性实验。他在秋季终止给患有花叶病的盆栽烟草浇水，等其枯死后再拔出烟草，并将粘在烟草根部的土放回盆中。第二年春天，他在干放了一个冬季的盆子里栽了几颗健康烟草。他发现，这些健康烟草最终都不同程度地患了花叶病。贝杰林克由此推定，烟草花叶病的致病因子即使在干燥的土壤中也能越冬，而且这些致病因子在春天会经由新栽培的烟草根部、茎部，感染烟草叶子，使其出现花叶病斑。

尽管当时的实验条件和对细胞的认识有限，但贝杰林克的上述推论和假设有不少后来被证明与事实还是相当吻合的。

4. 吕夫勒和菲洛施：牛口蹄疫致病因子是“极小生物”

值得注意的是，贝杰林克只在论文题目和两个小节的标题中使用了“传染性活流质”（contagiumvivum fluidum）这一术语，在论文的正文中，贝杰林克提及该因子时，都用“contagium”（触染物）或“virus”（病毒）表示，后者更为常见。

根据《牛津英语词典》的解释，“Virus”一词源自于拉丁语，其字面意思是“粘稠的液体，毒素”，在中世纪晚期的英语中主要指“蛇的毒液”。实际上，“Virus”的含义在贝杰林克1898年发表上述文章之前一直没有发生过太大的变化。因此，在十九世纪后期，人们在表达生物体内增殖的“poison”（毒素）之意时，会根据自己的喜好选择“contagion”（触染物）、“germs（病菌）”、“bacteria”（细菌）或“virus”。它表明，这一时期“virus”仍未被赋予滤过性病原体的含义，它和“触染物”、“病菌”、“细菌”可以互换使用。

1890年，微生物学之父巴斯德提出著名的论断：“tout virus est un microbe”（所有的病毒都是微生物）。但是，时过8年之后，贝杰林克就将“virus”用来指代“传染性活流质”。

贝杰林克的“传染性活流质”的概念包含这几层含义：①能通过细菌过滤器；②具有传染性；③能在生物体内增殖，但不能在体外生长。简言之，病毒是一种滤过性病原体。

贝杰林克如此对病毒概念进行重塑与德国的细菌学家、科赫的弟子吕夫勒（Friedrich Loeffler，1852-1915）和菲洛施（Paul Frosch，1860-1928）的工作有着一定的关联。

1882年，科赫在柏林生理学学会上宣布，他找到了结核病的病原体，这一重大发现在学界掀起了一波寻找疑难病病原菌的热潮。科赫的助手吕夫勒（Friedrich Loeffler，1852-1915，图6-37）同年就发现了类鼻疽杆菌，1884年又培养出了白喉杆菌。积累了丰富的细菌学研究经验后，吕夫勒又和菲洛施合作于1897年在柏林传染病研究所启动了牛口蹄疫病原体的探究。如上所述，贝杰林克也是在这一年启动烟草花叶病研究的。

图6-37  吕夫勒（Friedrich Loeffler，1852-1915） 

牛口蹄疫是一种病毒性传染病，吕夫勒和菲洛施研究后发现，牛患口蹄疫后，其淋巴液中含有能通过细菌过滤器的传染性物质，而且这种口蹄疫致病因子小到无法通过光学显微镜观察到，也无法在培养基上培养。还有，病牛淋巴液的滤液经过高度稀释后，仍然具有传染性，因此可排除其为化学毒素的可能性。

吕夫勒曾长期在科赫身边工作，他对科赫确立的细菌致病理论深信不疑。因此，尽管牛口蹄疫的病原体具有滤过性，但他仍然不会全面修正细菌致病理论。吕夫勒和菲洛施认为，牛口蹄疫病原体虽然能够通过连最小的细菌都无法通过的过滤器滤孔，但它仍是一种微粒（corpuscular）。与人类和动物罹患的很多其他传染病，例如天花、牛痘、猩红热、麻疹、伤寒和牛瘟等一样，其病原体都是这种“极小生物体”（minutest organisms）。

吕夫勒和菲洛施将上述研究成果整理成了4份研究报告，并于1897年9月发表了一份德文的研究摘要，可能因为没有过滤实验记录，没有引起贝杰林克的关注。但贝杰林克在1898年的论文中提到了吕夫勒1898年独立发表的第4份研究报告。毋容置疑，贝杰林克在研究过程中受到了吕夫勒对牛口蹄疫病原体的研究影响。但是，二人在滤过性病原体究竟是微粒还是流质一事上看法截然不同。因此，贝杰林克在1898年的论文中批评了吕夫勒的滤过性病原体微粒说。

要而言之，贝杰林克发现烟草花叶病病原体的时间点与吕夫勒和菲洛施发现牛口蹄疫病原体的时间点几乎没有差异。而且他们都用实验表明滤过性病原体是一种客观存在。只是双方对实验结果的解释不同，贝杰林克认为这种新病原体是“传染性活流质”，不是细菌；吕夫勒和菲洛施认为这种新病原体乃迄今为止从未遇到过的一种极其细小的微粒，除体度外和细菌没有太大的差异。

但是，若将滤过性病原体的发现等同于病毒的发现，那么将病毒发现者的荣冠戴在贝杰林克的头上还不如戴在吕夫勒和菲洛施的头上更合适。实际上，伊万诺夫斯基早在1892年就已发现了滤过性病原体，只是他对当时观察到的实验现象没有进行深究罢了。

5. 杜加尔：烟草花叶病致病因子是可在细胞内增殖的微粒 

迈入20世纪后，跻身烟草花叶病毒研究领域的学者越来越多。因电子显微镜的普及是1939年以后的事，故20世纪初期人们对烟草花叶病毒的研究只能是言人人殊。当时，人们讨论得最多的问题是，烟草花叶病毒究竟是不是微粒？它是不是微生物？

1899年，美国农业部植物产业局专家伍兹（Albert F. Woods，1866-1948） 在研究叶绿素变色问题时意识到树叶入秋后由绿变黄可能是叶内的氧化酶的作用结果。他由此推测某些植物病变，譬如烟草花叶病有可能是因叶内的氧化酶或过氧化酶活性增强所致。

稍后进入美国农业部植物产业局担任专家的奥拉德（Harry A. Allard，1880-1963）对毒素说表示怀疑。他1916年在对伍兹的实验研究进行追试后指出，氧化酶不是引发烟草患花叶病的原因。他发现，患花叶病的烟草叶子的汁液用这种多孔杯过滤后，滤液中确实含有高活性的氧化酶，但这种滤液几乎没有传染性。它表明烟草花叶病病原体已被多孔杯过滤掉了。尽管是偶然发现，但它却很好地证明了烟草花叶病病原体是可被吸附的颗粒。

奥拉德还发现，烟草花叶病病原体不仅能够被云母吸附，而且使用高浓度的乙醇对其进行处理后病原体还会失去活性。不过，使用45%-50%的乙醇进行处理时，病原体仍然会保持较强的活性，同时还会出现沉淀。

奥拉德的研究引起了美国著名的植物生理学家、植物病理学拓荒者杜加尔（BenjaminM. Duggar，1872-1956，图6-38）的注意。杜加尔1898年在康奈尔大学取得博士学位后，曾赴美国农业部担任过一年的植物生理学专家，1912年开始涉足烟草花叶病研究。

图6-38  杜加尔（BenjaminM. Duggar，1872-1956）

杜加尔和其研究助理使用奥拉德的方法制得烟草花叶病病原体的沉淀物后，通过与已知物质颗粒的大小进行比对，于1921年推定，烟草花叶病致病因子的大小与血红蛋白相近，直径大约为30纳米，体积大约是一般细菌的1/37000。杜加尔在研究过程中还发现，用45%-50%的乙醇处理后获得的烟草花叶病致病因子好几天后仍具有传染性。此前有研究表明，枯草菌的芽孢对高浓度的乙醇也具有耐受性，两者的性质似乎没有本质上的差异。杜加尔感到很好奇，于是和其研究助理对烟草花叶病致病因子和枯草菌的芽孢展开了比较研究。结果，枯草菌的芽孢在玛瑙研钵中研磨3小时后就失去活性，而烟草花叶病致病因子研磨9个小时后仍然具有一定的传染性。

杜加尔给出的解释是，枯草菌的芽孢在研磨过程中由于细胞结构被破坏了所以才失去活性，烟草花叶病致病因子的体积只有枯草菌芽孢的1/37000，由于不可能拥有枯草菌芽孢那样的细胞结构，所以长时间研磨后仍未失去传染性。这意味着烟草花叶病致病因子乃有别于细菌的微粒。

杜加尔在1923年的上述论文中指出：目前，认为烟草花叶病致病因子是细菌的观点可能是完全错误的；被广泛接受的观点是烟草花叶病致病因子乃“病毒”。这种病毒在细胞内具有非同寻常的活性，但脱离细胞后，和任何没有细胞结构的胶体粒子一样没有活性。总体看来，花叶病毒的行为更像是生物胶体，但它具有复制力。

在该文的末尾，他写道：“花叶病的致病因子可能是宿主细胞的间歇性产物，但不是像酶那样简单的产物，更像是构成染色质的颗粒或具有某种遗传结构，譬如基因那样的颗粒。也就是说，它摆脱了宿主细胞中各种调节机制的束缚，并被赋予了自我复制的能力。”至于颗粒状的烟草花叶病致病因子自身究竟有没有生命？杜加尔并没有回答。

由上可知，在一些美国学者看来，致使烟草患花叶病的病毒乃滤过性病原体，但它既不是“传染性活流质”，也不像具有细胞结构的“极小生物”，而是可在细胞内进行自我复制的超显微颗粒。问题是这种颗粒状的病毒究竟是什么？

6. 斯坦利：烟草花叶病毒是一种蛋白质

一战后初期，在烟草花叶病毒研究领域表现最为突出的研究团队当属博伊斯汤普森植物研究所的昆克尔实验室。昆克尔（Louis O. Kunkel，1884-1960）早年曾在美国农业部植物产业局研究过土豆病毒病，1920年去夏威夷工作后主要研究甘蔗病毒病，1923年他接受新成立的汤普森植物研究所的聘请来到纽约，负责组建植物病毒学实验室。该实验室很快就吸引来了一批对烟草花叶病毒研究抱有浓厚兴趣的学者。其中的代表人物有普尔蒂（H.A.Purdy）、霍姆斯（F.O.Holmes）和文森（C.G.Vinson）。

普尔蒂在研究过程中发现，患有花叶病的烟草叶汁中存在一种健康烟草叶汁中没有的特殊物质，而且用烟草花叶病毒感染同为茄科的番茄、矮牵牛、辣椒等植物后，其叶汁中同样含有这种物质，但在受其他病毒感染的烟草叶汁中并没有找到这种物质。实验表明，将该特殊物质与使用兔子制备的抗烟草花叶病毒血清混合后，其感染性会被中和。很明显，这种具有抗原性的特殊物质源自于烟草花叶病毒。由于已有研究表明，具有抗原性的物质通常都是蛋白质，所以普尔蒂在1928年推定烟草花叶病毒中含有蛋白质。

霍姆斯在阅读与烟草花叶病有关的研究文献时注意到，有多篇文章提及将患有花叶病的烟草叶汁接种到某些烟草属植物的叶子上之后，该片叶子上会出现局部病斑。于是，他给17种烟草属植物接种了患有花叶病的烟草叶汁，其中5种植物的叶子上出现了局部病斑。霍姆斯确认这些局部病斑都是由烟草花叶病毒感染引起的。他认为可以用受感染叶子上的局部病斑数量来检测所接种的烟草花叶病毒的浓度。于是，他于1929年开发出了使用心叶烟草定量检测烟草花叶病毒浓度的新方法。这种方法不仅耗时短、精度高，而且简单易行。此项研究为烟草花叶病毒的提纯带来了极大的便利。

文森在处理被烟草花叶病毒感染的烟草病叶提取液时发现，添加藏红、丙酮、乙醇等沉淀剂后，传染性物质会发生沉淀。而且，添加藏红后沉淀的那些被认为是病毒的传染性物质，不再具有传染性，但去除其中的藏红后，又会恢复传染性。文森认为这可能是传染性物质与藏红发生反应造成的，他于1931年推定这种化学物质与酶类似。此外，文森还注意到，用丙酮处理烟草病叶提取液时，会有结晶析出。不过，这种结晶的传染性不强，而且含有不少杂质。尽管他试图用结晶的方式提取分离烟草花叶病毒，但一直没有成功。

从烟草病叶的提取液中成功分离出烟草花叶病毒晶体的是美国洛克菲勒医学研究所的生物化学家斯坦利。

1932年，在时任所长西蒙·弗莱克斯纳（Simon Flexner，1863-1946）的主导下，洛克菲勒医学研究所将位于普林斯顿的动物病理学部扩充为动物与植物病理学部，并聘请昆克尔担任新设立的植物病理学部门主任。昆克尔到任后，除了将霍姆斯等一批老部下带到新单位之外，还将刚满28岁的斯坦利（Wendell Meredith Stanley，1904-1971，图6-39）纳入麾下。

图6-39  斯坦利（Wendell Meredith Stanley，1904-1971） 

斯坦利曾在伊利诺伊大学跟随在美国盛誉的著名化学家罗杰·亚当斯（Roger Adams，1889-1971）教授学习有机化学，于1929年获得博士学位。之后，他又赴德国慕尼黑跟随1927年的诺贝尔化学奖得主海因里希·维兰德（Heinrich Wieland，1877-1957）教授做与天然物化学有关的博士后研究。这两个经历为他进入科研经费充裕的洛克菲勒医学研究所开展烟草花叶病毒结晶研究奠定了重要基础。

斯坦利1933年启动烟草花叶病毒结晶研究之前，已有研究表明，烟草花叶病毒可能含有蛋白质；提纯所需的快速测定烟草花叶病毒浓度的方法已经确立；从溶液中制备高纯度晶体蛋白酶已有成功先例。关于第3点，需要再做些补充说明。而且，1926年康奈尔大学生物化学助理教授萨姆纳（James B. Sumner，1887-1955）成功地从刀豆中提取分离出晶体脲酶，这是生物化学史上首次获得的晶体酶。

受其鼓舞，洛克菲勒医学研究所研究员诺斯罗普（John H. Northrop，1891-1987）重启了胃蛋白酶的研究与制备工作，并于1930年从一种商业胃蛋白酶制剂中分离出了晶体胃蛋白酶。此后，他又与人合作分离出了多种蛋白酶及其前体，从而使酶是蛋白质这一发现成为学界共识，并且积累了丰富的制备晶体蛋白酶的经验。

在此一系列前人工作的基础上，斯坦利很快就获得了高浓度的烟草花叶病毒提取物。斯坦利发现，胰蛋白酶虽然能抑制这种烟草花叶病毒提取物的传染性，但其传染性仍能恢复，而胃蛋白酶则能使其水解，从而彻底失去传染性。据此，他于1934年得出结论：烟草花叶病毒是一种蛋白质，或与某种蛋白质密切相关。其后，对烟草花叶病毒在不同氢离子浓度下的灭活速率的研究也同样支撑这一结论。这一结论无疑有助于斯坦利将目标直接锁定蛋白质结晶的制备来设计接下来的浓缩与纯化烟草花叶病毒的研究进路。

由于方向明确、路线正确、条件优越，斯坦利1935年就从烟草病叶的提取液中成功地浓缩、分离出了高纯度的烟草花叶病毒结晶。

该结晶即使稀释10亿倍或重复结晶10次仍然具有传染性。而且，给动物注射这种结晶后获得的抗血清能够抑制烟草花叶病毒的传染性。斯坦利随即就将这项研究结论发表在当年的《科学》杂志上。他在这篇文章中明确指出：“烟草花叶病毒被认为是一种自催化蛋白质，就目前而言，它的增殖可能需要活细胞的存在。”“该蛋白质的分子量，大约是几百万。”

在西门子公司于1939年首次推出实用电子显微镜之前，科学家们虽然有足够的证据断定烟草花叶病毒是一种不同于细菌的微粒，但一直无法借助光学显微观察到病毒。

在根本看不到病毒的情况下，要将病毒分离出来进行培养，进而对其本质展开深入探究，无异于缘木求鱼。斯坦利独辟蹊径，采用化学方法从患有花叶病的烟草叶子的提取液中成功分离出烟草花叶病毒结晶，使烟草花叶病毒变成一种既“看得见”又“摸得着”的一种蛋白质。这一贡献无疑推动了人们从分子水平去进一步认识病毒的本质，促进了生物学与化学以及生物学与物理学的交叉融合，并为分子生物学的诞生奠定了重要基础。

斯坦利因在病毒蛋白质的分离、纯化与结晶方面贡献突出，1946年与萨姆纳、诺斯罗普一道被授予诺贝尔化学奖。这是病毒研究领域的第一个诺贝尔奖。

7. 电子显微镜问世：人类成功观察到病毒

斯坦利从患有花叶病的烟草叶子的提取液中浓缩、分离出蛋白质结晶，并用实验证明这种蛋白质结晶具有传染性，亦即能够进行自我增殖。自我增殖乃生物才具有的属性，如果像蛋白质这样的化学物质的确具有自我增殖能力，那么生命和物质之间的界限岂不需要重新划分？

面对年轻的化学家提出的挑战，生物学家不可能无动于衷，那些坚信病毒是生物，晶体蛋白质不是生物，因而不可能是病毒的生物学家最初的反应是对斯坦利的研究结论表示怀疑。

理论上讲，病原体的确定必须遵循生物学家公认的“科赫法则”，即：

（1）所有烟草病叶中都应含有烟草花叶病毒，但健康的烟草叶子中不能有。在这种情况下，我们并不知道烟草花叶病毒是导致烟草叶子受感染的原因，还是烟草叶子受感染后出现的结果。

（2）从烟草病叶中分离出烟草花叶病毒，并进行纯培养或纯化处理。如果不能获得无杂质的纯粹烟草花叶病毒，根本就无法做单一要素可控实验。而非单一要素实验，对其结果无法进行明确归因。

（3）用纯烟草花叶病毒给健康烟叶接种，健康烟叶都会发生相同病变。如果健康烟叶接种烟草花叶病毒后并没有都发生病变，那意味着导致病变的并不只是烟草花叶病毒，可能还有其他未知因素参与作用。

（4）从接种后发生病变的烟草叶子中仍能分离出烟草花叶病毒，而且分离出的病毒能与抗烟草花叶病毒血清混合后会发生中和，亦即特异性应答。如果发生病变的烟草叶子中未必都确定有烟草花叶病毒，那么烟草花叶病的病原体究竟是什么，仍然不能完全断定。

斯坦利1935年在《科学》杂志上发表的那篇论文不足2页，由于写得过于简练，引起一些质疑。但他在1936年发表的一篇论文中详细地介绍了自己的具体研究过程和所获得的数据。从中可以看出，他的烟草花叶病毒结晶研究从整体上讲是符合“科赫四原则”的基本精神的。

比起生物学家，化学家对斯坦利的质疑则要尖锐得多。当时，化学家提出的主要问题是，烟草花叶病毒结晶的纯度如何？它果真只是蛋白质？

从1935年的论文中可以看出，斯坦利从烟草花叶病毒结晶中并没有测出磷，只是说测出了1%的灰分，而且测出的含氮量高达20%，与已知的蛋白质含氮量不符。

这意味着他在使用硫酸铵盐析法和硅藻土过滤法制备烟草花叶病毒结晶过程中很有可能没有完全去除硫酸铵。在1936年的论文中，他虽然更正了含氮量的数值，但仍然没有测出含磷量。

1936年，英国洛桑农业实验站植物病理部门的鲍顿（F.C.Bawden）和剑桥大学病理系的皮里（N.W.Pirie）合作对自己混合使用硫酸铵盐析法和等电点沉淀法精制出的烟草花叶病毒结晶进行检测后发现，结晶中的含氮量为16.7%，含磷量为0.5%，含糖量为2.5%。

他们深入研究后指出：烟草花叶病毒大约是由95%的蛋白质和5%的核糖核酸（RNA）组成的核酸蛋白质复合体。

而且，他们还基于烟草花叶病毒溶液具有各向异性推定烟草花叶病毒颗粒呈杆状。这意味着病毒并不像人们通常想象的那样是非常小的细菌，而是一种完全不同的实体。

鲍顿和皮里虽然证明了烟草花叶病毒中含有RNA，但是他们当时并没有发现RNA作为基因组携带着重要的遗传信息。RNA具有增殖能力，亦即传染性直到1956年才被德国科学家吉尔（A. Gierer）和施拉姆（G. Schramm）发现。

1956年，吉尔和施拉姆将烟草花叶病毒放在水和苯酚中震荡，使RNA与蛋白质分离后，再用提纯过的RNA去给烟草接种，结果烟草叶子上出现了典型的花叶病斑。而当用核糖核酸酶对RNA进行处理后，再给烟草接种，烟草叶子上并不会出现病斑。

经过一系列实验验证之后，吉尔和施拉姆指出，RNA是一种遗传物质，烟草花叶病毒的RNA成分在接种后的烟草叶片中能够诱导合成出新的烟草花叶病毒。

1957年，佛兰科尔-康拉特 （H. Fraenkel-Conrat）和辛格尔（B. Singer）通过病毒的重建进一步证实了吉尔和施拉姆的上述结论（图6-40）。

图6-40  佛兰科尔-康拉特和辛格尔的病毒重建实验示意图 

鲍顿的弟子哈里森（B. D. Harrison）曾在文章中谈到，鲍登和皮里当时曾就RNA是否具有传染性的问题进行过实验研究，可能是由于两人的实验室相距有50英里，等皮里把分离出的RNA运送给鲍登时RNA已经失活，所以鲍登和皮里未能发现RNA的传染性。

尽管鲍登和皮里推定烟草花叶病毒颗粒呈杆状结构，但是直到1939年才被柏林帝国生物学研究所的生物化学家古斯塔夫·阿道夫·考舍（Gustav Adolf Kausche，1901-1960）等人确认。

如众所知，1933年，两位德国年轻人恩斯特·鲁斯卡（Ernst Ruska，1906-1988）与波多·冯·波里斯（Bodo von Borries，1905-1956）合作，成功地研制出了全球第一台分辨率超过光学显微镜的电子显微镜（图6-41）。

图6-41  全球第一台电子显微镜

但这台电子显微镜结构比较简单，实用性不强。1938年，二人在西门子公司的支持下又合作研制出2台结构更加合理、功能更为齐全、放大率可达3万倍的实用电子显微镜试制品，其中1台旋即交给了恩斯特·鲁斯卡的胞弟，同时也是波多·波里斯的妻兄哈尔墨特·鲁斯卡（Helmut Ruska，1908-1973，图6-42）测试使用。在此基础上，西门子公司于1939年正式推出第1台商用电子显微镜。

图6-42  哈尔墨特·鲁斯卡（Helmut Ruska，1908-1973） 

哈尔墨特·鲁斯卡是学医的，当时正在柏林大学查理特医学院实习，他坚信电子显微镜有助于促进医学和生物学的发展，因此1938年拿到电子显微镜后就开始尝试着用它来观察多种亚微观生物。1939年他又协助考舍等人使用电子显微镜成功地观察到了烟草花叶病毒。

考舍等人为了增加对比度，将烟草花叶病毒与胶体金混合，不仅在电子显微镜中观察到了烟草花叶病毒，而且还获得了第一张烟草花叶病毒的电镜照片。根据考舍等人的观察，“烟草花叶病毒分子”呈杆状，其直径大约为15纳米，长度为150或300纳米。

斯坦利等人1941年也使用电子显微镜对晶体烟草花叶病毒进行了观察，这两个团队的观察结果高度吻合。

这样，自贝杰林克1898年使用“病毒”一词特指滤过性病原体以来，人们终于用自己的眼睛看到了病毒颗粒，并确认它是含有RNA成分、具有传染性的核酸蛋白质复合体。只是后来随着电子显微镜技术的不断发展，人们对杆状烟草花叶病毒体度和结构的把握更加精准罢了。

8. 结  语

19世纪末20世纪初，巴斯德、科赫等人提出的细菌致病学说正处于鼎盛时期。当时，传染病皆由细菌或其毒素引起的观点获得了广泛认同。因此，当可以通过细菌过滤器的新型病原体——烟草花叶病毒被“发现”之后，俄国的伊万诺夫斯基、德国的吕夫勒和菲洛施等人仍然不愿意抛弃既有的理论和概念，将这种新型病原体继续视作一种细菌。荷兰学者贝杰林克虽然改造了传统的“病毒”概念，并赋予其全新的涵义——“传染性活流质”，但很少有人表示接受。因为根据以往的经验人们很难想象非颗粒形态的流质也像单细胞细菌那样具有生命力。

一战结束后不久，美国植物病理学家杜加尔基于自己的实验研究将“病毒”的概念发展成为可在细胞内自我增殖的微粒，但他既没有见到这种微粒状的病毒，也不知道这种微粒状的病毒究竟是什么？因此，当美国生物化学家斯坦利借助当时最先进的酶蛋白质结晶技术于1935年制得烟草花叶病毒结晶，并指出“病毒”是一种蛋白质时，在学术界引起了热议，因为这种“病毒”概念颠覆了很多人对生命和物质的认知。

自我增殖被认为是只有生命才具有的属性，如果作为化学物质的蛋白质确实具有这种属性，那么生物与非生物的界限在哪里？

尽管对斯坦利的研究表示怀疑的人有很多，但用事实修正了斯坦利的研究结论的唯有英国的鲍登和皮里。

鲍登和皮里1936年用无可争辩的实验数据证明烟草花叶病毒中除含有大量的蛋白质外，还含有少量的RNA，只是人们当时并没有意识到这种RNA才是病毒的遗传物质。鲍登和皮里还从这种核酸蛋白质复合体具有各向异性，推出烟草花叶病毒应该是杆状颗粒，而不是球状颗粒。

在电子显微镜的发明人、1986年诺贝尔物理学奖得主恩斯特·鲁斯卡的弟弟哈尔墨特·鲁斯卡的协助下，德国生物化学家考舍于1939年终于观察到了烟草花叶病毒，并确认其为杆状颗粒。

从最初推定烟草花叶病毒为滤过性病原体，到直接观察到这种滤过性病原体为一种亚微观颗粒，人类整整用了41年。

在这段时间里，很多科学家都为人类加深对病毒的理解做出了重要的贡献。

不可否认的是，这些科学家虽然在研究烟草花叶病毒的过程中都得出了一些符合事实的有价值的结论，但是他们的论文或报告中也都存在着这样或那样的错误，要么实验结果不完全符合事实，要么构建的病毒概念不完全正确。简言之，没有一篇论文或报告没有错误，只是当时未必有人能够发现罢了。

至于没有为加深对病毒的理解做出贡献，甚至对病毒概念的形成产生严重误导的论文或报告则不计其数。如果当时的人们对这些论文或报告推崇备至，将这些论文或报告的作者视若神明，不仅不利于病毒概念的形塑，甚至会阻碍科学的发展。

怀疑的世界真理多，盲信的社会谬误多。科学始于疑问，过去是如此，现在也是这样。通过回顾和深描烟草花叶病毒的发现过程，我们还可以看到，科学的发展是累积性的，即使是重大发现通常也是由很多人共同完成的。因此，有必要在科学共同体内部建立平等对话和合作交流的机制。

要建立合作交流机制，首先需要建立一套大家都能理解的话语体系，不能自说自话；其次需要建设一批方便各国学者高效沟通的载体，不能画地为牢。可以说，无论是德国学者、俄国学者，还是美国学者、英国学者，如果大家在研究烟草花叶病毒过程中，不是基于普遍主义立场行动，就不可能建立起那么庞大的“行动者网络”，因而也就不可能形成那么强大的如实表征病毒本质的能力。

当代的中西传染病学也是一样，只有确立一套彼此都能够理解的话语体系，拥有基于普遍主义的立场，才能真正地切实行动起来，融入科学共同体的洪流之中，并获得自身的学术地位和未来的前景。