原文链接：In situ targeted base editing of bacteria in the mouse gut | Nature

Microbiome research is now demonstrating a growing number of bacterial strains and genes that affect our health1. Although CRISPR-derived tools have shown great success in editing disease-driving genes in human cells2, we currently lack the tools to achieve comparable success for bacterial targets in situ. Here we engineer a phage-derived particle to deliver a base editor and modify Escherichia coli colonizing the mouse gut. Editing of a β-lactamase gene in a model E. coli strain resulted in a median editing efficiency of 93% of the target bacterial population with a single dose. Edited bacteria were stably maintained in the mouse gut for at least 42 days following treatment. This was achieved using a non-replicative DNA vector, preventing maintenance and dissemination of the payload. We then leveraged this approach to edit several genes of therapeutic relevance in E. coli and Klebsiella pneumoniae strains in vitro and demonstrate in situ editing of a gene involved in the production of curli in a pathogenic E. coli strain. Our work demonstrates the feasibility of modifying bacteria directly in the gut, offering a new avenue to investigate the function of bacterial genes and opening the door to the design of new microbiome-targeted therapies.

摘要

微生物组研究现在正在证明影响我们健康的细菌菌株和基因数量不断增加1。尽管 CRISPR 衍生工具在编辑人类细胞中的致病基因方面取得了巨大成功2，但我们目前缺乏在原位细菌靶标上取得类似成功的工具。在这里，我们设计了一种噬菌体衍生的颗粒来传递碱基编辑器并修改小鼠肠道中的大肠杆菌。在模型大肠杆菌菌株中编辑 β-内酰胺酶基因导致单剂量目标细菌群体的中位编辑效率为 93%。经过编辑的细菌在治疗后至少在小鼠肠道中稳定维持 42 天。这是使用非复制性 DNA 载体实现的，从而防止有效载荷的维持和传播。然后，我们利用这种方法在体外编辑了大肠杆菌和肺炎克雷伯菌菌株中几种具有治疗相关性的基因，并展示了在致病性大肠杆菌菌株中原位编辑参与产生卷曲的基因。我们的工作证明了直接在肠道中改造细菌的可行性，为研究细菌基因的功能提供了新的途径，并为设计新的微生物组靶向疗法打开了大门。

图 1：为小鼠肠道中的大肠杆菌设计一种高效、选择性的 DNA 递送载体。

a，Ur-λ 噬菌体注射机制示意图。左图，噬菌体 Ur-λ 吸附到大肠杆菌细胞中。基因 stf 编码固定在基板上的长附属物，通过与 OmpC 外膜孔蛋白相互作用，促进噬菌体吸附到目标细菌上。尾尖蛋白 gpJ 识别 LamB 外膜孔蛋白，在 gpJ 与其受体结合后，gpH 蛋白允许 DNA 通过周质注射到细菌细胞质中。右图，工程化的 λ 衍生颗粒，其中 λ-P2 STF 嵌合体识别 LPS，gpJ 嵌合体识别 OmpC。b，通过流式细胞术测量 gpJ 粘粒变体与编码 sfGFP（质粒 p513）的有效载荷进入大肠杆菌 s14269 的递送效率（激发，488 nm；发射，530/30 BP）。 x 轴上的 MOI 表示包装的粘粒与细菌的比例；y 轴表示孵育 45 分钟后 GFP 群体的百分比。该图显示了三次重复实验的平均值和标准偏差。c，菌株 MG1655-bla（gpJ A8，λ-P2 STF 嵌合体）上 β-内酰胺酶的 MOI 依赖性腺嘌呤（ABE gRNA bla，p1396）和胞嘧啶碱基编辑（CBE gRNA bla，p2327）。显示了具有非靶向 SapI 间隔物的对照样品（ABE gRNA SapI，p2771；CBE gRNA SapI，p2770）。y 轴表示羧苄青霉素平板上每微升的菌落形成单位 (CFU)。该图显示了三次重复实验的平均值和标准偏差。面板 a 使用 BioRender.com 创建。+

图 2：非复制性 DNA 有效载荷可以有效地编辑目标细菌群体。

a，cosmid条件复制示意图。复制需要引物酶蛋白和引物酶复制起点 (Primase-Ori)。b，体外质粒稳定性时间过程分析。携带可诱导引物酶质粒的细菌在无诱导物 (蓝色) 或 100 µM DAPG (黄色) 下生长。携带 sfGFP 基因 (p1324) 的粘粒以约 40 的 MOI (红色箭头) 递送。使用流式细胞仪分析来自不同时间点的样本。该图显示了重复进行的三次实验的平均值和标准偏差。虚线表示转导前细胞的背景荧光。 c、携带诱导 (+) 或未诱导 (-) 引物酶质粒的细胞被携带条件复制起点的有效载荷转导，孵育 5 小时并接种于 (1) 溶源性肉汤琼脂、(2) 含 25 µg ml-1 氯霉素的溶源性肉汤琼脂或 (3) 含 50 µg ml-1 卡那霉素、25 µg ml-1 氯霉素和 100 µM DAPG 的溶源性肉汤琼脂上。d、使用非复制性有效载荷 (p2328) 对 bla 进行体外腺嘌呤碱基编辑。MG1655-bla 在存在 (蓝色) 或不存在 (黄色) 引物酶表达 (质粒 p1321) 的情况下进行转导。 2 小时后，将以不同 MOI 转导的细胞接种到含有羧苄青霉素的溶源性肉汤中。e、通过下一代测序分析 MG1655-bla 中的在靶和脱靶编辑。Illumina 测序数据中的错配频率显示为参考基因组中所有 20 个碱基对子序列，后跟 NGG PAM，与目标序列最多有 7 个错配，包括 10 个 PAM 近端核苷酸中的最多 2 个。条形表示每个脱靶中频率最高的碱基的错配频率。每个脱靶的序列、坐标和邻近基因列于补充数据 1 中。显示用 ABE 或对照处理的样品的两个生物学重复的数据。

图 3：BALB/c 小鼠肠道中 E. coli MG1655-bla 的靶向腺嘌呤碱基编辑。

a，实验设置摘要。定殖五天后，用装有 gpJ 1A2 和 λ-P2 STF 嵌合体以及靶向 bla 基因的 ABE 的包装粘粒治疗小鼠。在一个组中，我们研究了剂量反应，在另一个组中，我们研究了多次剂量对治疗效果的影响，跟踪动物长达 6 周 (w)。剂量滴度以传导单位 (tu) 来测量。b，浓度降低的单剂量在不同时间点的编辑效率。点表示单个小鼠（每组 n = 10），条表示中位数 ± 95% 置信区间（****P < 0.0001，通过单因素方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 多重比较检验）。 c，多次处理后的编辑效率（图表上标明的 P 值；不显著 (NS)，通过 Tukey 多重比较检验的重复测量方差分析，P > 0.05；处理以 x 轴上的黑色箭头表示；n = 9 只动物）。条形图代表平均值±s.d，在粪便中恢复并通过 ddPCR 量化的有效载荷 (cp) 的拷贝数。条形图代表组中位数（图表上标明的 P 值；通过 Dunn 多重比较检验的 Kruskal-Wallis 检验，NS P > 0.05；n = 10 只动物）。D0，第 0 天；T0，时间 0。面板 a 使用 BioRender.com 创建。

图 4：使用非复制性 DNA 有效载荷在体外对致病性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌菌株进行靶向碱基编辑。

a，使用含有 λ-K1F STF 嵌合体和 gpJ 1A2 的载体对菌株 UTI89 中的靶基因 clbH、clbJ 和 cnf1 进行 MOI 依赖性胞嘧啶碱基编辑。CBE 将提前终止密码子插入到靶基因中。b，使用含有 λ-KL106 STF 嵌合体和 gpJ A8 的载体对肺炎克雷伯菌 ST258 中的靶基因 fimH、fimK 和 aph(3′)-Ia 进行 MOI 依赖性胞嘧啶碱基编辑。CBE 将提前终止密码子插入到靶基因中。 c，使用含有 λ-K5 STF 嵌合体和 gpJ A8 的载体，对菌株 TN03 中的 csgA 起始密码子 (ATG 到 ACG) 进行 MOI 依赖性的腺嘌呤碱基编辑。d，体外对 TN03-csgA 中的靶向和脱靶腺嘌呤碱基编辑 (ABE8e，质粒 p2515) 进行下一代测序分析。Illumina 测序数据中的错配频率显示在参考基因组中具有 NGG PAM 的所有 20 个碱基对子序列中，与目标序列的错配最多有七个，包括十个 PAM 近端核苷酸中的最多两个。条形图表示每个脱靶中频率最高的碱基的错配频率。每个脱靶的序列、坐标和邻近基因列于补充数据 2 中。显示的数据是用 ABE 或对照处理的样品的两个生物学重复。 a–c 中所示的碱基编辑实验重复进行（1 和 2）。

图 5：使用非复制性有效载荷对包装的 λ 粘粒进行处理后，BALB/c 小鼠肠道中大肠杆菌 TN03 基因组上的 csgA 基因进行靶向腺嘌呤碱基编辑。

a，实验设置摘要。定植五天后，用包装的粘粒处理小鼠，该粘粒配备有 gpJ A8 和 λ-K5 STF 嵌合体，编码针对 csgA 基因的 ABE。在一个组中，我们研究了剂量反应，在另一个组中，我们研究了多剂量对治疗效果的影响。b，以降低的浓度单剂量给药 24 小时后的编辑效果（每组 n = 10 只独立动物，****P < 0.0001，通过单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验）。条形表示平均值±标准差。 c，在用 1 × 1010 颗粒治疗前 (D4) 和治疗后 (D12) (n = 10 只动物) 通过宏基因组 16S 测序量化的科级细菌组成；所有小鼠和时间点的数据均在扩展数据图 10 中提供。从第一到第三四分位数绘制方框，中线代表中位数；须延伸到每个类别的最小值和最大值，排除以黑色菱形显示的异常值。d，随时间推移单个小鼠肠道微生物组组成变化，表示为与 D5 样本的加权 UniFrac 距离。分析了用 1 × 1010 颗粒治疗的小鼠的粪便样本 (n = 9 只动物)。绘图方式与 c 相同。e，多次治疗后的编辑效果（图上标明 P 值；NS，通过单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验，P > 0.05；n = 14 只动物）；治疗用 x 轴上的黑色箭头表示）。点表示单个小鼠，条形表示组中位数，适用时具有 95% 置信区间。面板 a 使用 BioRender.com 创建。