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2015 ABC RP-HPLC同时纯化伊枯草菌素、丰原素和表面活性素的MALDI-TOF-MS/MS脂肽异构体鉴定

已有 462 次阅读 2024-5-14 18:48 |个人分类:生物农药|系统分类:科研笔记

原文链接:Identification of lipopeptide isoforms by MALDI-TOF-MS/MS based on the simultaneous purification of iturin, fengycin, and surfactin by RP-HPLC | Analytical and Bioanalytical Chemistry (springer.com)

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Abstract

A three-stage linear gradient strategy using reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) was optimized for rapid, high-quality, and simultaneous purification of the lipopeptide isoforms of iturin, fengycin, and surfactin, which may differ in composition by only a single amino acid and/or the fatty acid residue. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS/MS) was applied to detect the lipopeptides harvested from each reversed-phase HPLC peak. Amino acid analysis based on phenyl isothiocyanate derivatization was further used for confirmation of the amino acid species and molar ratio in a certain HPLC fraction. By this MALDI-TOF-MS/MS coupled with amino acid analysis, it was revealed that iturin at m/z 1,043 consists of a circular Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser peptide and C14 β-OH fatty acid. Surfactin homologs from Bacillus subtilis THY-7 at m/z 1,030, 1,044, 1,058, and 1,072 possess a circular Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu peptide and the β-OH fatty acid with a different length (C13–C16). Fengycin species at m/z 1,463 and 1,477 are homologs possessing the circular peptide Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Ile linked to a C16 or C17 γ-OH fatty acid, whereas fengycin at m/z 1,505 contains a Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr-Ile sequence with a Val instead of Ala at position 6. The method developed in this work provided an efficient approach for characterization of diverse lipopeptide isoforms from the iturin, fengycin, and surfactin families.

摘要

使用反相高效液相色谱法(HPLC)优化了三阶段线性梯度策略,以快速、高质量和同时纯化脂肽异构体伊枯草菌素、丰原素和表面活性素,它们的组成可能仅因单一氨基酸和/或脂肪酸残基而异。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法(MALDI-TOF-MS/MS)检测从每个反相HPLC峰收获的脂肽。基于异硫氰酸苯酯衍生化的氨基酸分析进一步用于确认某一HPLC级分中的氨基酸种类和摩尔比。通过该MALDI-TOF-MS/MS与氨基酸分析相结合,揭示了在m/z 1043处的伊枯草菌素由环状Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser肽和C14β-OH脂肪酸组成。来自枯草芽孢杆菌THY-7的m/z 1030、1044、1058和1072的表面活性素同源物具有圆形Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu肽和不同长度的β-OH脂肪酸(C13–C16)。在m/z 1463和1477处的丰原素物种是具有与C16或C17γ-OH脂肪酸连接的环状肽Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Ile的同源物,而在m/z 1505处的丰原素包含在位置6处具有Val而不是Ala的Glu-Orn-Tyr-Thr-Val-Pro-Gln-Tyr-Ile序列。这项工作中开发的方法为表征来自伊枯草菌素、丰原素和表面活性素家族的不同脂肽异构体提供了一种有效的方法。

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图1甲醇-水系统中不同洗脱策略的反相(RP)高效液相色谱(HPLC)色谱图。

a0–3分钟,50%甲醇至55%甲醇;3–13分钟,55%甲醇对85%甲醇;13–28分钟,85%甲醇对100%甲醇。

b0–3分钟,65%甲醇比75%甲醇;3–13分钟,75%甲醇对85%甲醇;13–30分钟,85%甲醇对100%甲醇。

c0–3分钟,75%甲醇对80%甲醇;3–10分钟,80%甲醇对85%甲醇;10-30分钟,85%甲醇比95%甲醇。

d 0–3分钟,70%甲醇对75%甲醇;3–8分钟,75%甲醇对85%甲醇;8–30分钟,85%甲醇对95%甲醇

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图2在乙腈-水系统中使用不同洗脱策略的RP-HPLC色谱图。

a初始策略,以从30%乙腈增加到100%乙腈的线性梯度洗脱60分钟。

b策略I,梯度程序为从0到10分钟的50%乙腈到75%乙腈,然后从10到20分钟的75%乙腈到100%乙腈。

c策略二,梯度程序如下:40%乙腈从0到3分钟;从40%乙腈到50%乙腈的反应时间为3到8分钟;50%乙腈至80%乙腈,时间为8-13分钟;和80%乙腈到100%乙腈的反应时间为13到30分钟。

d最终优化的有效三阶段策略为:45%乙腈至50%乙腈,时间为0至3分钟;50%乙腈至80%乙腈的反应时间为3至8分钟;以及从80%乙腈到100%乙腈的8到25分钟。

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图3高效液相色谱峰中脂肽混合物和异构体的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)光谱。

a在m/z范围1000–1100的高质量强度中,含有表面活性素和伊枯草菌素离子,在m/z区域1400–1600的高质量密度中,包含丰原素离子。

b、 c与级分1和2相关的伊枯草菌素在m/z 1043和1057以其质子化形式显示高质量强度,在m/z 1065和1079以钠加合物显示高质量密度。

d、 e在与级分5和6相关的位置6处含有具有Ala或Val的C17脂肪酸链的质子化丰原素,在m/z 1477和1505处显示高质量强度。

f、 g含有与级分9和10相关的C14和C15脂肪酸链的表面活性素异构体,分别在m/z 1030和1058处,以[m+Na]表示+

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图4在m/z 1043处的伊枯草菌素前体离子的MALDI-TOF-MS/MS光谱。

该光谱显示在m/z 212、299、524、638、801和915处的前体离子的b+片段和在m/z 406、520、745和832处的前驱体离子的y+片段。m/z 1043处的前体离子被证实是由Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser和C14脂肪酸链组成的伊枯草菌素。

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图5含有C13–C16脂肪酸链的表面活性素前体的MALDI-TOF-MS/MS光谱。

a表面活性素前体离子[M+Na]+,M/z 1030,含有Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu肽和C13β-羟基脂肪酸链。

b表面活性素前体离子[M+Na]+,M/z 1044,含有C14β-羟基脂肪酸链。

c表面活性素前体离子[M+Na]+,M/z 1058,含有C15β-羟基脂肪酸链。

d表面活性素前体离子[M+Na]+,M/z 1072,含有C16β羟基脂肪酸链

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图6含有Glu-Val-Leu-Leu-Asp-Leu-Val肽的表面活性素的异构体。

a表面活性素前体离子[M+Na]+,M/z 1030,含有C14β羟基脂肪酸链。

b表面活性素前体离子[M+Na]+,M/z 1044,含有C15β羟基脂肪酸链

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图7  丰原素前体离子的MALDI-TOF-MS/MS光谱。

a m/z 1463处的前体离子,位置6处有Ala,含有C16γ-羟基脂肪酸链。

b m/z 1477处的前体离子,位置6处的Ala,含有C17γ-羟基脂肪酸链。

c m/z 1505处的前体离子,位置6处的Val,含有C17γ-羟基脂肪酸链

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图8 C18-RPHPLC获得的氨基酸的异硫氰酸苯基衍生物的色谱图。

a标准氨基酸:Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe、Trp和Lys。

b级分5中m/z 1477的水解样品,Ala位于位置6。

c级分6中m/z 1505的水解样品,Val位于位置6

表1本研究中RP-HPLC级分中脂肽结构的分配

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