原文链接：Modular metabolic engineering of Bacillus amyloliquefaciens for high-level production of green biosurfactant iturin A | Applied Microbiology and Biotechnology (springer.com)

Abstract

As a kind of biosurfactants, iturin A has attracted people’s wide attentions due to their features of biodegradability, environmentally friendly, etc.; however, high production cost limited its extensive application, and the aim of this research wants to improve iturin A production in Bacillus amyloliquefaciens. Firstly, dual promoter was applied to strengthen iturin A synthetase expression, and its yield was increased to 1.25 g/L. Subsequently, original 5′-UTRs of downstream genes (ituA, ituB, and ituC) in iturin A synthetase cluster were optimized, which significantly increased mRNA secondary stability, and iturin A yield produced by resultant strain HZ-T3 reached 2.32 g/L. Secondly, synthetic pathway of α-glucosidase inhibitor 1-deoxynojirimycin was blocked to improve substrate corn starch utilization, and iturin A yield was increased by 34.91% to 3.13 g/L. Thirdly, efficient precursor (fatty acids, Ser, and Pro) supplies were proven as the critical role in iturin A synthesis, and 5.52 g/L iturin A was attained by resultant strain, through overexpressing yngH, serC, and introducing ocD. Meanwhile, genes responsible for poly-γ-glutamic acid, extracellular polysaccharide, and surfactin syntheses were deleted, which led to a 30.98% increase of iturin A yield. Finally, lipopeptide transporters were screened, and iturin A yield was increased by 17.98% in SwrC overexpression strain, reached 8.53 g/L, which is the highest yield of iturin A ever reported. This study laid a foundation for industrial production and application development of iturin A, and provided the guidance of metabolic engineering breeding for efficient production of other metabolites synthesized by non-ribosomal peptide synthetase.

摘要

伊图林A作为一种生物表面活性剂，因其可生物降解、环境友好等特性而引起了人们的广泛关注；然而，高昂的生产成本限制了其广泛应用，本研究旨在提高贝莱斯芽孢杆菌中伊图林A的产量。首先，采用双重启动子来增强伊图林A合成酶的表达，将其产量提高至1.25克/升。随后，对伊图林A合成酶簇中下游基因(ituA、ituB和ituC)的原始5'-UTR进行优化，显著提高了mRNA的次级稳定性，结果菌株HZ-T3产生的伊图林A产量达到2.32克/升。其次，阻断α-葡萄糖苷酶抑制剂1-去氧诺基霉素的合成途径，以提高底物玉米淀粉的利用率，将伊图林A产量提高了34.91%，达到3.13克/升。第三，高效的前体(脂肪酸、丝氨酸和脯氨酸)供应被证明是伊图林A合成中的关键因素，通过过表达yngH、serC，并引入ocD，结果菌株获得了5.52克/升的伊图林A。同时，删除了负责合成聚-γ-谷氨酸、胞外多糖和表面活性素的基因，导致伊图林A产量增加了30.98%。最后，筛选了脂肽类运输蛋白，过表达SwrC蛋白的菌株中，伊图林A产量增加了17.98%，达到8.53克/升，这是迄今为止报道的伊图林A产量最高的研究结果。本研究为伊图林A的工业生产和应用开发奠定了基础，并为其他非核糖体肽合酶合成的代谢产物的高效生产提供了代谢工程育种的指导。

图1 解淀粉芽孢杆菌HZ-12的模块化代谢工程，以增强伊图林A的生产，包括伊图林A合成酶基因簇、底物利用、前体（脂肪酸、丝氨酸和脯氨酸）供应、副产物合成和伊图林A运输等模块。

表1 本研究所用的菌株和质粒

图2 在HZ-12（野生型菌株）中增强伊图林A合成酶簇的表达以提高伊图林A的产量。A 伊图林A产量和细胞生物量，以及B ituA、ituB、ituC和ituD基因的转录水平。

图3 优化 HZ-T1 中 ituB、ituC 和 ituD 基因的5'-UTRs（ituD采用 HZ-Pdual3-ituD）以增强iturin A的产量。 A Iturin A产量和细胞生物量，B 具有其原始5'-UTR的ituB基因的mRNA二级结构，以及 C 具有ituB基因的UTR12的mRNA二级结构。

图4 通过阻断HZ-T3（HZ-Pdual3-ituD-UTRUTR12-ituA-UTRUTR12-ituB-UTRUTR9-ituC）中1-DNJ合成途径来提高玉米淀粉利用率，从而增加iturin A的产量。A Iturin A产量和细胞生物量，以及B 1-DNJ产量和α-葡萄糖苷酶活性。

图5 强化 HZ-T4（HZ-Pdual3-ituD-UTRUTR12-ituA-UTRUTR12-ituB-UTRUTR9-ituC△gabT1）中的前体（脂肪酸和氨基酸）供应，以增加iturin A的产量。A Iturin A产量和细胞生物量，B 脂肪酸浓度，C 前体氨基酸添加对iturin A产量的影响，D 强化iturin生产的前体Ser和Pro合成途径，E 基因serC和serB的转录水平，以及F 细胞内Ser和Pro的浓度。

图6 阻断HZ-T11（HZ-Pdual3-ituD-UTRUTR12-ituA-UTRUTR12-ituB-UTRUTR9-ituC△gabT1-PbacA-yngH-PbacA-serC-PbacA-ocd）中的副产物合成途径，用于iturin A的合成。A Iturin A产量和细胞生物量，以及B 副产物γ-PGA、细胞外多糖和界面活性素的产量。

图7 在HZ-T13（HZ-Pdual3-ituD-UTRUTR12-ituA-UTRUTR12-ituB-UTRUTR9-ituC△gabT1-PbacA-yngH-PbacA-serC-PbacA-ocd△pgsB△epsAB△srfA）中过表达脂肽类运输蛋白，以增加iturin A的产量。A Iturin A产量和细胞生物量，以及B 菌株HZ-12和HZ-T14的发酵过程曲线。

表S1 本研究使用的引物

表S2 HZ-T14 与其他iturin A 生产菌株产生的iturin A 滴定值比较

图 S1 ituB 和 ituC 基因5' UTR 的mRNA 二级结构。A：带有其原始 5' UTR 的 ituB 基因的 mRNA 二级结构，B：带有 ituB 基因的 UTR12 的 mRNA 二级结构，C：带有其原始 5' UTR 的 ituC 基因的 mRNA 二级结构，D：带有 ituC 基因的 UTR12 的 mRNA 二级结构。

图S2 启动子替换对yngH转录水平的影响。