2014 Environmental Microbiology: Taxonomic relatedness shapes bacterial assembly in activated sludge of globally distributed wastewater treatment plants

2014 Environmental Microbiology: 全球污水处理厂活性污泥中细菌组装的分类相关性

https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/1462-2920.12355 

摘要

活性污泥法（AS）是污水处理厂（WWTPs）中应用最为广泛的一种生物处理工艺，已有100多年的历史，其中细菌在污水处理厂的污染物去除中起着核心作用。然而，细菌类群与AS中特定功能细菌所占据的生态位之间的潜在关系还不清楚。在这里，基于相关性的网络分析被应用于一个16S rRNA基因焦测序数据集，该数据集包含来自全球污水处理厂的50个AS样本中的760000个以上的序列。结果表明：（1）AS中细菌组装是按分类学相关性非随机排列的；（2）生境过滤和竞争等多种确定性过程导致AS中的门内和门间共现率高于预期。此外，在细菌占位的基础上，一组普遍存在的世界性功能性核心菌（如多个氮循环相关细菌）在不同污水处理厂的AS中广泛分布，表现出较强的生态关联性。此外，AS网络具有与以往报道的生态网络相似的统计和结构特征，如幂律连通分布和非随机连通特性。总的来说，这项工作为AS细菌群落提供了新的见解，并揭示了在污水处理厂中指导细菌组装的生态规则。

前言

活性污泥（AS）作为世界上最常用的生物污水处理工艺，近一个世纪来一直被用于去除废水中的耗氧有机物和营养物质，微生物是其成功的驱动力。AS中的微生物群落被认为是真核生物（原生动物和真菌）、高度多样的细菌、古细菌和病毒的复杂组合，其中细菌的生物量占主导地位，并在污染物去除中发挥中心作用。近年来，我们对不同生境中微生物多样性的认识有了很大的提高，这主要是由于方法学的进步，例如分类标记的高通量测序（例如16S rRNA），这使得大量序列数据可用于探索微生物组分。借助16S rRNA基因扩增子的高通量测序，各种生物废水处理工艺（WWTPs）中的细菌多样性，特别是AS，以前所未有的高分辨率和覆盖率被揭示出来。这些优秀的研究评估了单个样本中的类群总数（如稀释曲线和香农指数），描述了单个细菌类群的相对丰度，并比较了多个空间分布AS样本（如共享和唯一类群，以及聚类和坐标分析）的细菌多样性和组成。相比之下，利用来自多个样本的序列数据来探索潜在的种间相互作用却没有受到重视。

基于相关性的网络分析已广泛应用于社会、计算机和生物科学等领域，以探索复杂系统中单个实体或项目之间的相互作用。产生的网络界面以一组节点和连接节点的边的形式承载有意义的统计和结构特征，这些特征可能揭示指导系统中群落组成和功能的基本规则。在过去的几年中，微生物生态学家成功地应用了基于相关性的网络分析来探索自然栖息地中微生物群落之间的共现模式，包括海水、淡水和土壤，其中非随机微生物组装模式显示为细菌域（如淡水和土壤）内或跨域（如海洋细菌、古细菌和原生生物之间的生态联系）的一般特征。然而，关于AS中的细菌相互作用知之甚少，AS是一个独特的人工微生物生态系统，具有高度多样性（超过700个属）和高生物量（通常为2-10 g L-1），尽管人们早就知道去除废水中的有机和无机污染物（例如硝化细菌转化铵为亚硝酸盐）很大程度上依赖于几个关键细菌群的共存，并且特定的细菌种类的出现也会对废水处理产生不利的影响，因为它们比营养去除所需的功能性微生物更具竞争力。

在这里，我们首次应用基于相关性网络分析的方法，通过调查共现模式来探索AS细菌群落之间的关联。我们分析了从全球城市/工业污水处理厂获得的50个AS样本中的76万多个细菌16S rRNA基因序列。本研究进行的网络分析验证了以下三个假设：（i）AS中细菌的组装是非随机的；（ii）多个确定性过程的联合作用导致AS细菌的共现比预期的多；（iii）相关功能细菌群的核心组应该共存，并且在不同的污水处理厂中广泛分布。最近对其他微生物生态系统的研究支持第一个和第二个假设，在这些研究中，微生物群落在海水、淡水和土壤中的共现模式显示为由确定性过程（例如竞争关系和非重叠生态位）驱动的非随机关联网络。第三个假设是基于在AS系统中保持特定功能细菌群的必要性，以维持其性能【例如铵氧化细菌（AOB）和亚硝酸盐氧化细菌（NOB）用于脱铵】和稳定性。总的来说，了解AS中的细菌共现模式对于识别具有已知和未知功能的细菌之间的潜在相互作用、揭示栖息地亲缘关系和揭示塑造细菌组装的确定性过程特别重要，最终可能确定影响AS污水处理厂效率和稳定性的因素，并有助于促进发展高效策略来提高处理性能。

结果和讨论

一般共现模式的棋盘得分测试

活性污泥絮体具有异质结构，其中含有高度多样的细菌群落，可有效消除污染物。先前的研究从多个方面考察了AS中的细菌多样性和动态，包括核心物种的分类丰富度和均匀度，塑造群落多样性的非生物因素，以及评估特定操作条件如何显著影响功能 【例如AOB、NOB和聚磷生物（PAO）】或有害微生物【例如膨胀和起泡细菌（BFB）】。众所周知，废水中某些有机污染物的降解和无机营养盐的转化通常涉及多个步骤，这些步骤得益于不同菌群之间的互利合作，但同时也受到依赖于同一基质生长的类群之间的竞争。因此，可以预见，应该出现非随机的物种间共现模式。

在这里，棋盘得分（C-score）测试被用作测量整个数据集中总体共现的生态度量。通过质量筛选和分类，建立了50个样品中869个细菌属的丰度矩阵。总的来说，C评分测试检测到了非随机共现模式，观察到的C评分（25.56）高于零模型下的平均值（C评分平均值=24.99，P值<0.0001）。将测试限制在那些具有显著且强相关性的属（图1和附表S2），度量值增加到81.71，显著（P值<0.0001）高于预期的C分数平均值74.77。观察到的C值高于零模型下的C值平均值，这反映了AS中至少有一些物种的共现率低于预期。附表S2显示部分AS菌属间存在较强的负相关，附表S4显示β变形菌中的属与β变形菌和放线菌中的属共现较少。这种比预期更隔离的微生物结构与69个微生物群落的关联矩阵的观察结果相呼应，并且与宏观生物的模式（44个数据集）也大体相似，其中观察到的非随机共现模式比预期的要多。这些非随机组装模式可能是确定性因素的结果，包括同营养关系、竞争性相互作用和生态位分化。总的来说，C评分测试使我们可以得出结论，AS中细菌的组装是非随机的。

图1  基于相关分析的活性污泥细菌属的共现网络。联系代表坚强（Spearman'sρ>0.6）与显著（P值<0.01）相关。A.按照门/纲着色的共现网络。B.按照属占位着色的共现网络。C. 按照模块着色的共现网络。每个节点的大小与连接数（即度）成比例；两个节点之间连接的厚度（即边）与Spearman相关系数的值成比例，范围从0.6到0.9。

共现模式的网络分析

一旦AS的微生物组装被证明是非随机的，则利用基于相关的网络分析进一步研究AS的共现模式。该分析能够有效检测成对类群-类群和类群-环境关系，已成功应用于识别海水和土壤中微生物之间的生态联系，以及海洋和湖泊微生物与其环境之间的相互作用。在整个AS细菌网络中，从110个细菌属中共鉴定出402对显著可靠的相关，强正相关的数量远远高于负相关的数量（附表S2）。如图1所示，AS细菌的阳性网络有107个节点（属），382个边，平均度（AD）：7.14；节点连接性的幂律分布见附图S2（表1），分布在10个主要细菌门/纲中（图1a）。计算了AS细菌阳性网络中用于描述各属间相互关系模式的显著拓扑性质，并将此真实网络与大小相同的Erdös–Réyni随机网络进行了比较。对于AS阳性网络，节点间最短平均路径长度（APL）为3.42，网络直径（ND，节点间最长距离）为8，高聚类系数（CC）为0.56。观察到的APL（3.42）、CC（0.56）和模块性[MD，0.54；值>0.4表明网络具有模块结构）均大于其各自Erdös–Réyni随机网络的APLr（2.57）、CCr（0.067）和MDr（0.29）（表1）。高CC/CCr比8.4（附表S3）有力表明相关网络具有“小世界”特性，即节点的连接比在相同大小的随机网络中的连接更多（有关网络拓扑的更多详细信息，请参阅附件S2）。

表1 活性污泥（AS）共现网络（图1和图2）的拓扑特性

进一步的网络结构分析表明，非随机的门/纲内共现模式在AS细菌群落中相当普遍。总体而言，来自同一门/纲细菌属的共现（19.1%）往往比在随机关联下（7.5%-7.8%）的预期多，尽管它们在门/纲内的共现程度不同（图1a，附件表S4）。在这里，我们计算了两个类群的观测共现发生率（O）即在它们之间观测到的边数占AS网络所有382个边的相对百分比，而随机共现发生率（R）是用两种不同的方法估计的：（i）RER是10000个相同大小的Erdós–Réyni随机网络中观测共现发生率的平均值；（ii）RTheo是通过考虑门/纲频率和随机关联计算的理论共现发生率。因此，观察到的（O）和随机（RER/RTheo）共现发生率之间的不一致程度可作为探索复杂微生物群落中非随机聚集模式的基准。

对于整个阳性网络，观察到的O与预期的RER/RTheo之间的不一致性在一个低丰度门（图3）中最为明显，即厚壁菌门，其成员倾向于共同出现，比随机关联（0.5%-0.6%）预期的多5.4-6.4倍（3.7%）。另一个世界性的门（酸杆菌相关的红色节点，图1b；图3）也显示出与随机期望相比，门内强共生关联的发生率更高（参见蓝色节点内的粗边，图1a）是酸杆菌，观察到的共现发生率为3.1%，而随机为0.8%（附表S3）。这一高度多样化的门已被证明在土壤中普遍存在，但在AS中的特征仍然很差，关于其在污水处理厂中的确切作用和生态意义的信息很少。尽管如此，本研究中的数据首次揭示了其在AS系统中的普遍性（尤其是在聚合物、纺织染色、吗啉和丙烯腈污水处理厂，附图S3）和相当大的多样性（检测到11个属，其中8个属共现）。有趣的是，与观察到的α-变形杆菌纲内共现率（7.6%）略高于预期（4.5%），大多数成员的聚集在网络模块II（图1c）相反，β-变形杆菌的共现率（3.7%）略低于预期（4.9%），其成员广泛分散到不同的网络模块中，可能揭示了存在确定的过程（例如生态位分化），抑制了β-变形杆菌的门内共现模式。

图3 不同微生物类群的相对丰度，基于每个属在每个活性污泥样品的16S rRNA序列中的序列百分比。

在本研究的AS网络中观察到的非随机的门/纲内共现模式以前已经被发现，但只有在土壤细菌群落的关联网络中，来自同一门的科水平操作分类学单位(OTUs)的显著共现远高于随机预期。这些模式可以解释为分类学相关性对微生物类群群落组装结构的影响，因此，分类学上密切相关的细菌属在生态学上也密切相关，这反过来反映了它们共同的生态位偏好或它们之间的协同关系。此外，在本研究中观察到的门/纲内物种之间的强共现模式与之前的研究结果有些一致，即淡水、土壤和沉积物样本中的细菌群落在系统发育上的聚集程度超过了偶然的预期。长期以来，细菌群落组装的生态规则在植物等大型生物中广泛存在，最有可能表明生境过滤在细菌群落组装中的重要性（例如，一组近缘类群可能都具有在特定生境中持续生存的显著特征）。

除了在门/纲内观察到比预期更高的共现事件外，在不同门/纲之间（即门/纲之间的共现）也发现了这种非随机模式。一个典型的例子是，厚壁菌门和放线菌门的成员显示出显著高于随机关联预期（1.4%）的门间共现发生率（5.8%）。在γ变形杆菌和厚壁菌、δ变形杆菌和酸杆菌以及其他门之间也发现了类似的模式。较少相关的细菌门之间的共生模式基本上与之前在植物或动物自然群落（如莎草群落和哺乳动物群落）中观察到的类群过度分散（即共现物种的亲缘关系比偶然发现的要小）一致，这不仅证实了系统发育过度分散可能是从微生物到宏观动植物所有生物群落的一个普遍特征，而且还表明了负面相互作用（如竞争）对群落组装的重要影响。总的来说，应该注意的是，系统发育聚类和过度分布可能共同作用，在AS中产生观察到的细菌群落，表明生境过滤可能与诸如竞争等负面关联一起发生，以形成AS中的细菌组装。

活性污泥通有类群及其在网络模块中的关联

基于丰度和占位划分生态群落是生态学的一个长期传统，有助于探索核心/普通和外围/特殊类群，并定义生态类别，提供系统发育、分类或功能多样性定义之外的额外信息。在这项研究中，那些以平均相对丰度>0.01%为代表的属被绘制在占有-丰度图中，将这些属分成三个任意定义的生态类别（他们的定义在图2标题中）：（i）AS通有类群（869个细菌属中的48个属），（ii）市政AS通有类群（40个属）和（iii）工业AS通有类群（3个属）。市政府AS通有类群的比例（4.6%）远高于（>15倍）工业AS通有类群的比例（0.3%），这很可能与市政AS细菌丰富度和均匀度（辛普森指数）远高于工业AS（附图S4a）有关。这意味着，市政和工业AS的细菌分布和多样性存在巨大差异，如前者细菌种类高度多样，分布更均匀，而后者细菌种类较少，但通常是相当独特的物种，且分布不均匀。一般来说，正丰度-占位关系被公认为是在许多空间尺度上广泛存在的宏观生态分布模式。然而，在这项研究中没有观察到这种趋势。例如，一些分布较窄的属（靠近图2水平和垂直轴原点的大圆）丰富较高，而许多分布广泛的属（远离原点的小圆）丰富很低。这一结果表明，尽管本研究中分析的所有AS样品都来源于污水处理厂的AS，但本研究中所涉及的废水成分（如来自不同地理位置的废水，来自不同行业的工业废水）和操作参数（如温度和污泥停留时间）可能会影响正丰度-占位关系。例如，几个分布较窄的属，包括Olivibacter, Roseiflexus 和 Sporosarcina，丰度非常高（平均丰度为总16S rRNA标签的1.2%～4.5%），但仅在乳清过滤、纺织和丙烯腈工业废水AS中被检测到。

图2 在21个市政（X轴）和29个工业（Y轴）活性污泥样品（AS）中各属的占位-丰度图。在占位-丰度图（图3）中，以平均相对丰度大于0.01%为代表的每个细菌属被划分为三个任意定义的生态类别：（i）AS通有类群（48个属）在至少60%的市政（12个样本）和60%的工业（18个样本）中广泛分布；（ii）市政AS通有类群（40个属），在至少60%的市政AS出现，在不超过20%的工业AS（6个样本）中出现；和（iii）工业AS通有类群（3个属），在至少60%的工业AS中出现，在不超过20%的市政AS（4个样本）中出现（图3）。圆的大小与相应属的平均相对丰度成比例，在0.01%～4.5%之间，没有显示重叠的内圆。

总体而言，AS相关网络在AS通有类群和市政AS通有类群中分别表现出明显的聚集性和强相关性（图1b中红色和黄色节点中的显著相关性）。重要的是，这两个人工定义的生态类别主要位于网络（图1b模块I，图1c模块II和III）的三个最大模块（即与随机关联相比，物种群间的互作大于与其他物种的互作）中，AS通有类群在第一和第三模块中是非常明显的，市政AS通有类群在第二模块更为明显。将网络划分为模块（或子网络）已被证明是一种有效的群落结构检测技术，它可能揭示执行不同功能的不同节点组。

对于AS细菌的阳性网络，网络模块的形成可能对应于功能分化的细菌簇的共存，这些细菌簇适应于AS中组合的多个生态位。一方面，在模块I（图1c）中，与氮代谢密切相关的世界性AS通有类群（图1b）间具有强大的生态联系，表现为一组可靠的共现关系（生丝微菌属是中心），包括一个众所周知的β-变形杆菌纲的AOB亚硝基螺旋菌，三个α-变形杆菌纲的反硝化菌（来自生丝微菌科的生丝微菌属和黄杆菌属，和来自β-变形杆菌纲的陶厄氏菌属）和两个α-变形杆菌纲的固氮菌（NFB，中生根瘤菌和慢生根瘤菌）（附图S5A）。这些广泛存在的氮循环相关的AOB和反硝化菌之间的共现关系很可能是建立在协同关系的基础上的，其中一种菌的产物可以被另一种菌当作底物利用。值得注意的是，虽然缓生根瘤菌和中根瘤菌被称为固氮菌，但它们通常只在与植物共生的关系中固氮，而在像AS这样的含氮环境中，它们可能具有不同的作用。另一方面，发现有证据支持以下假设：模块二代表了一组细菌，这些细菌非常偏爱城市污水处理厂的特定生境特征和生活方式，即生活污水负荷低，易于生物降解。首先，大多数共现的市政AS通有类群（总共12个城市中的10个）聚集在这个模块中，形成密集连接的亚群（图1b中的黄色节点）。在工业WWTPs中，这些属的占位很少可能是由于工业废水中通常存在的苛刻性质，如低生物降解性、高有机负荷和强毒性或酸性。第二，虽然疣微菌门仅在市政AS（附图S3下）中丰度较高，但所有共现的疣微菌门相关的属（图1a）均在模块II中出现。特别是，在模块II中检测到高度互连的人类肠道或粪便相关细菌亚群，包括双歧杆菌、链球菌、布劳特氏菌、乳球菌和乳酸杆菌（附图S5b）。尽管这些细菌只占市政AS细菌群落的一小部分（平均占16S rRNA序列总数的1.6%），但似乎是最初从家庭中排出后，它们穿过城市下水道，最后进入市政污水处理厂，在那里与AS絮体合并。

活性污泥功能通有类群及其相互联系

考虑到特定功能菌群在维持AS的处理性能（例如AOB和NOB）或影响生物过程稳定性（例如BFB）方面的关键作用，有理由相信，这些功能菌群中大多应该是世界性的AS通有类群，广泛分布于数千个污水处理厂。在本研究中，AS通有类群由分布广泛的48个细菌属组成，它们隶属于丰度较高的门，如变形杆菌（尤其是α-和β-分支）、拟杆菌（主要是鞘氨醇细菌）和酸杆菌（图3，每个门的第三栏）。正如预期的那样，AS通有类群中约37.5%个（18个属）之前被作为功能类群报道，包括3个硝化细菌，9个反硝化细菌，2个固氮细菌，3个BFB，和一个糖原累积生物体（GAO）（下划线属，图4；附图S4B），说明在全球收集的50个市政和工业AS样本中，一组核心功能通有类群是普遍存在的。此外，关于AS功能通有类群和其他通有类群之间的共现关联，图5展示出了30个AS通有类群的共现，它们之间识别出43个可靠的成对关联（附表S5）。在这些相关性中，最显著的是AOB亚硝化螺旋菌与反硝化菌生丝微菌之间的相关性（Spearman's ρ为0.64～0.69），它们作为氮循环相关菌的频繁共现是协同关系对微生物组装影响的典型例子。然而，值得注意的是，与污水处理厂中氮循环相关的另外两个AS功能通有类群，包括另一个AOB亚硝基单胞菌和一个NOB硝化螺旋菌，并未显示出与任何可识别细菌属之间的统计上的强相关性（因为图1中未出现代表它们的顶点），尽管他们一直以合作伙伴的身份从AS处理中去除铵而闻名。此外，在4个酸杆菌相关的通有类群中（即Gp16、Gp6、Gp3和Gp4，附图S5c）发现了很强的共现关联，这在之前的AS中很少有报道，可能是由于对同一生态位的偏好。有趣的是，普遍存在的蛭弧菌（bdellovirio）与两种革兰氏阴性反硝化细菌（Comamonas和Acidovorax）（图4，附图S5c）之间存在显著的正相关关系，bdellovirio是一种特殊的细菌属，专门作为其他革兰氏阴性细菌的掠食者生存，这很可能来自于在AS中常见的捕食关系。

图4 在50个活性污泥（AS）样品中24个功能属的相对丰度（对数标度）。相对丰度计算为分配给类群的序列数除以样本中16S rRNA基因序列总数。18个带下划线的属是广泛分布于所有活性污泥样品中的AS功能通有类群。

图5 基于相关分析的活性污泥通有类群共现网络。每个边代表一个强（Spearman'sρ>0.6）和显著（P值<0.01）相关。每个节点的大小与连接数成正比（即度）。边的厚度与给定Spearman的ρ成比例，范围从0.6到0.9。

最后评论

这项研究展示了基于大型空间尺度的焦磷酸测序细菌数据集，利用相关性的网络分析与强大的统计方法相结合，探索AS中细菌群落的组装模式。这项研究的结果提供了对AS中细菌组装结构的初步了解，并揭示了有趣的模式，包括非随机细菌组装、确定性过程形成的门/纲内和间的强共现关系，以及高比例的功能通有类群。还应提及的是，所观察到的共现模式将根据所选择的系统发育分辨率的水平而变化（例如，在门或纲的水平上观察到的共现可能比在OTU水平上观察到的更大）。此外，技术上的限制，如与DNA提取和PCR相关的偏差，可能会影响我们的结果。为了更好地理解AS功能微生物共存的潜在驱动力，鼓励今后在更有目的性的实验设计基础上进行研究。这类研究应探索特定环境变量或操作参数梯度上的时间序列群落动态，最终可能揭示污水处理厂微生物群落的组装规律，帮助识别在AS系统中必须维持的功能微生物的种类，以保证良好的处理性能和工艺稳定性。

实验流程

采样描述

用于网络分析的数据集是利用焦磷酸测序获得的16S rRNA基因片段（附表S1、S1-S17和S34 -S50），包括我们从亚洲（中国大陆、香港和新加坡）和北美洲（加拿大和美国）收集的34个AS样本，以及先前研究人员从位于韩国和阿根廷的不同规模污水处理厂收集的16个AS样本（附表S1、S18-S33）。我们按照之前的流程对AS样品进行收集和保存，这些样品的地理位置、废水机构（市政与工业）和气候（温度范围为10-34°C）（支持信息表S1）分布广泛。

分子方法

对于每个采集的AS样品，使用土壤FastDNA旋转试剂盒从2.0 ml污泥中提取基因组DNA，并使用NanoDrop-1000光谱仪测定DNA浓度。根据AS处理的废水类型，将提取的DNA分为两组。第一组包括从17个工业AS样品中提取的DNA，这些样品按照附件S1中描述的方法准备进行焦磷酸测序。第二组包含17个市政污水处理厂的AS样品，按照之前描述的方法，在同一测序平台上准备进行焦磷酸测序。焦磷酸测序的AS的16S rRNA序列已存入NCBI短序列档案数据库，其检索号为SRR987663和SRR987664。

序列处理

来自16S rRNA扩增子焦磷酸测序的所有原始测序数据在Mothur v.1.25.0中进行处理（Schloss等人，2009）。简单地说，按照Mothur手册中的标准做法，首先对序列进行demultiplexed、质量修剪、对齐，最后用ChimeraSlayer检查以去除嵌合序列。用RDP Classifier 2.5在50%置信阈值下对Mothur之后的16S rRNA基因序列进行分类，这提供了在足够的分类精度和最大化可分类序列百分比之间的折衷。

为了确保统计上显著的共现模式得到充分的解决，必须有一个覆盖足够的空间或时间梯度的大样本集，以允许分类群的丰度有足够的可变性。在网络分析中，我们考虑了关于AS的已发表的几乎所有的16S rRNA焦测序数据集。由于整合我们的数据集和先前文献的网络分析中，包含了覆盖16s rRNA基因稍微不同的高变区的序列，因此对AS中共现模式的探索是基于分类类群而不是OTU。为了在所有样本之间进行公平的比较以便进行下游分析，通过划分每个样本中的细菌序列总数（平均每个样本15 285个序列），将每个分类单元的序列数转换为相对丰度。所得到的矩阵表显示了每个属的相对丰度，包含438274个分类序列，分布在869个细菌属中，占所有50个样本中16s rRNA基因序列总数的59.5%[21个市政AS和29个工业AS]。

统计和网络分析

在零模型下（其中微生物分类群之间没有相互作用）使用C分数作为全群落物种共现模式的度量。C分数计算2×2物种矩阵的数量，其中每个物种只出现一次，但出现位点不同，C分数测试使用R VEGAN软件包中的oecosimu函数使用顺序交换随机化算法和30000个模拟。此外，为了可视化网络界面中的相关性，我们通过计算在20%以上AS样本中出现的154个细菌属(相对丰度之和超过AS总体的2.5%)之间的所有可能的成对Spearman秩相关性，构建了一个相关性矩阵。这一初步过滤步骤去除了那些在非常低丰度下被检测到或仅在有限数量样品中出现的代表性差的属，在很大程度上抑制了那些只有很少非零观察的低丰度细菌之间的人为联系，从而降低了网络复杂度，极大地促进了AS群落核心的检测。如果Spearman的相关系数（ρ）大于0.6（或<-0.6），P值小于0.01，则认为两个物种之间的相关性在统计学上是可信的。为了减少获得假阳性结果的机会，使用Benjamini–Hochberg方法对P值进行多重测试校正。从属丰度的两两比较中识别出的所有可信的相关形成了一个相关网络，其中每个节点代表一个属，每个边代表节点之间的强而显著的相关性。同时，生成了10000个Erdós–Réyni随机网络，其节点数和边数与真实网络相同，每个边被分配给任何节点的概率相同（附件图S1）。为了比较AS细菌网络和相应的随机网络的拓扑结构，计算了AD、ND、MD、CC和APL等一系列拓扑性质。所有上述统计分析均在R中的VEGAN、igraph和Hmisc包中进行。使用交互式平台Gephi进行网络可视化和模块检测。

补充材料

支持信息S1：分子方法

支持信息S2：活性污泥细菌网络的拓扑性质

支持信息S3：用于分析物种共现模式的R命令

图

图S1活性污泥细菌群落网络分析流程图

图S2：活性污泥相关网络（实心圆）和相同尺寸的随机网络（空心正方形）的节点度分布。

图S3 在50个活性污泥样品中酸杆菌门（上）和疣微菌门（下）的相对丰度。

图S4 在50个活性污泥样品中功能属的相对丰度。

图S5活性污泥中不同组的细菌属之间强和显著相关的例子。

表

表S1在全球污水处理厂（WWTPs）收集的50个活性污泥样本和用于网络分析的454个数据集

表S2活性污泥细菌属间强（Spearman'sρ<-0.6）和显著（P值<0.01）的负相关。

表S3活性污泥（AS）微生物共现网络的聚类系数和平均路径长度及其与其他真实生态网络和相应的Erdós-Réyni随机网络的比较

表S4观察到的门/纲内和间共现发生率与随机关联预期的共现发生率。

表5活性污泥通有类群（图4中的节点）与共现样本数量之间的相互关系。

支持信息S1：分子方法

对于第一组的17个工业AS样品，用338F（5’-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3’）和802R（5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'）扩增16S rRNA基因的V3-V4区域（约465个核苷酸）。在前引物5'末端，对测序过程中的样本混合条形码进行了修改。在100ml反应系统中进行PC：使用MightyAmp聚合酶和i-Cycler在94℃下变性5min， 35个循环（94℃50s，40℃30s，72℃90s），72℃延伸5min。每个样品产生的条形码PCR产物首先被纯化，然后以质量相等的浓度混合，最后在香港大学基因组研究中心的Roch 454 FLX钛平台上测序。

支持信息S2：活性污泥细菌网络的拓扑性质

对于AS网络，观察到的APL（3.55）、CC（0.55）和模块化（MD，0.57；值>0.4）表明该网络具有模块结构，均大于相应的Erdós-Réyni随机网络的APLr（2.74）、CCr（0.057）和MDr（0.35）（表S1）。高CC/CCr比10.2有力表明相关网络具有“小世界”特性，即节点的连接比在相同大小的随机网络中的连接更多（有关网络拓扑的更多详细信息，请参见补充信息S1）。

尽管效应大小（以CC/CCr的对数响应比衡量）小于土壤微生物网络（3.31），但它远高于其他生态网络，如食物网网络（1.20-1.34）和草地土壤功能基因网络（0.79-1.28），略高于海洋三域（细菌、古生菌和原生动物）网络（1.81），与传粉植物网络的上限（2.39）相当。有趣的是，在本研究中，单域（细菌）活性污泥微生物网络的CC值为0.43，高于双域（细菌和古细菌）土壤微生物网络的CC值0.33，并且两者均高于海洋三域网络的CC值0.27。这可能表明细菌域的类群之间的强共现率高于细菌类群与古细菌或真核生物域的类群之间的强共现率。较高的CC意味着AS细菌网络比其他生态网络包含更多高度相关的边（关系），比较这些网络之间的拓扑性质，可以深入了解不同生境类型的一般特征对不同微生物群落组装结构的影响。

基于模块化分类，整个网络可以被分为7个主要模块（即与随机关联相比，物种组内互作比与其他物种互作更大），在107个顶点中，有82个被3个大模块占据，即模块I, II和III（图1c）。两种类型的中心（高度连接的节点）出现在AS共现网络中：（1）在一个模块内高度连接的属（即模块内中心，例如Hyphomicrobium, Prosthecobacter, Thiobacter）和（2）在多个模块之间充当“连接器”的属（即模块间中心，例如Clostridium XI, Variovorax, Gp16）。在“小世界”AS细菌网络中，小型高度连接的中心的出现，使其更易于改变，而从网络中消除中心将极大地改变其结构。因此，这些中心可以被视为AS中的微生物“关键物种”。特别是模块间中心对于AS网络中不同模块间的关联非常重要（例如，Gp16连接模块I和III）。在模块II和III中，模块间中心的数量和顶点度远远超过模块内中心的数量和顶点度（图1c），可能揭示AS网络中这两个模块之间具有非常紧密的联系。

支持信息S3：用于分析物种共现模式的R命令

a)          C-得分计算

oecosimu (data.matrix, nestedchecker, method="swap", nsimul=30000)

b)         Spearman’s 相关性计算

rcorr (t(data.matrix), type="spearman")

c)          调整P值的多重检验校正

p.adjust (p.matrix, method="BH")

d)         利用igraph生成图

graph.adjacency(qualified.data.matrix., weight=T, mode="undirected")

e)          生成10000个 Erdös-Réyni 随机图

for (i in 1:10000) {

g <- erdos.renyi.game(107, 382,'gnm',weight=T,mode="undirected")

     g<- simplify(g1)

  V(g)$label <- taxonomy (name)

     V(g)$degree <- degree(g)

     write.graph(g, paste(i,".random.gml", sep = ""),format='gml'}

补充图

图S1 活性污泥细菌群落网络分析流程图

图S2 活性污泥相关网络（实心圆）和相同尺寸的随机网络（空心正方形）的节点度分布。节点度（即，连接节点的边的数量）是根据节点在网络中具有该度的概率P（k）绘制的。实线表示活性污泥相关网络度分布的幂律拟合（R²=0.92），虚线表示随机网络度分布的高斯拟合（R²=0.91）。对于整个活性污泥（AS）细菌网络，节点度分布最好遵循无标度幂律分布（P(k)= 0.3446*(1+k)-0.9665；R²=0.92，图S1），这是由于新顶点优先附着到更高连接的顶点。这与相同大小的随机网络的泊松形状（最好用高斯曲线拟合，R²=0.91）完全不同（图S1）。尽管AS细菌网络的幂律分布指数远小于在许多大型网络（如社会或蛋白质相互作用网络）中观察到的典型系数2-4，但该值与某些其他生态网络（例如海洋微生物网络）和一些食物网非常接近。这些生态网络之间的结构相似性，与随机性预测的高斯连通性分布相反，也表明在细菌网络中存在有意义的非随机关联。

图S3 在50个活性污泥样品中酸杆菌门（上）和疣微菌门（下）的相对丰度。相对丰度的计算方法是，分配给类群的序列数除以样本中16S rRNA基因序列总数。

图S4 市政（S1-S21）和工业（S22-S50）活性污泥（AS）样品在以下方面的比较：（I）细菌丰富度、均匀度和多样性；（II）两组AS中具有显著差异（t检验，P值<0.05）的功能组。在图A中，0.01和0.1%截断代表计算一个属存在的最小支持（相对）丰度。在图b中，每个属方框上方的星号代表差异的显著性：*P值<0.05，**P值<0.005，**P值<0.0005。方框图表示观测的标准化结果，其中方框表示四分位范围，触须表示第0百分位和第100百分位，加号表示异常值。带下划线的属是AS功能通有类群（至少出现在60%的AS样品中），广泛分布于所有活性污泥样品中。图S4a显示市政AS的细菌多样性和丰富度高于工业AS。图S4b显示了24个功能组中的8个（图4）在市政和工业AS之间具有显著不同的丰度（t检验，P值<0.05）。例如，市政AS中的Dechloromonas 和Nitrosospria含量较高，而工业AS中的Hyphomicrobacterium, Defluviicoccus， Thauera含量较高。

图S5 活性污泥中不同组细菌属之间强且显著相关的例子。当Spearman相关系数（ρ）>0.6，P值<0.01时，相关系数为强且显著。每个子图的X轴对应于单个WWTP的ID（表S1），Y轴相对表示总16S rRNA热标签库中每个分类单元。