2020 Nature Communications：A predator-prey interaction between a marine Pseudoalteromonas sp. and Gram-positive bacteria

2020 Nature Communications：海洋假互变单胞菌与革兰氏阳性菌的捕食相互作用

捕食相互作用在海洋有机质循环中起着重要作用。从海洋沉积物中分离到一株革兰氏阴性菌（Pseudoalteromonas sp. CF6-2）能通过分泌金属蛋白酶Pseudoalterin杀死具有多种肽聚糖（PG）化学类型的革兰氏阳性菌。酶的分泌需要II型分泌系统。Pseudoalterin与革兰氏阳性细菌PG的聚糖链结合，降解PG肽链，导致细胞死亡。释放的营养物质，包括PG衍生的D-氨基酸，可以被CF6-2菌株用于生长。Pseudoalterin的合成是由PG降解产物如甘氨酸和富含甘氨酸的寡肽诱导的。编码Pseudoalterin样蛋白的基因在许多其他海洋细菌中都有发现。这项研究揭示了海洋中一种新的微生物相互作用。

图1菌株CF6-2对革兰氏阳性菌的捕食。

a菌株CF6-2对琼脂平板上8株革兰氏阳性海洋细菌的杀灭作用。菌株CF6-2被点接在每个含有指示菌株细胞的平板上生长3天，直到CF6-2菌落周围形成一个透明圈。MCCC0423，华纳葡萄球菌MCCC1A00423（肽干，Ae（q）Ka；肽桥，GGGGG）12；MCCC4032，黄体微球菌mccc1a0432（肽干，Ae（q）Ka/Ae（G）Ka；肽桥，EG/Ae（G）Ka）16；CF12-9，芽孢杆菌CF12-9（肽干，Ae（q）Ka/AeKa/AeKa；肽桥，G/d（n）/Ad）16；MCCC5863，孢子虫aquimarina MCCC1A05863（肽干，AeKa；肽桥，Ge）16，51；mccc664，链霉菌属mccc1a066664（肽干，Ae（q）pa；肽桥，G）16，52。McCC55 34，盐生杆菌McCC1A055 34（PGcontaining Lys，Orn，Ala，GLY，Glu）16, 53；McCc85 10，Exig杆菌属McC1A085 10（肽柄，Ae（Q）Ka；肽桥，G）；McCc9411，外口细菌深海嗜压菌MCC1A09411（肽柄，Ae（Q）Ka；肽桥，G）54。对照，菌株CF6-2在琼脂平板上，没有任何其他细菌。各菌株的PG化学类型如括号所示。图中显示了三次实验的一个代表。b在20℃人工海水中共培养时菌株CF6-2对MCCC0423的捕食作用。c描述用于研究菌株CF6-2与MCCC0423之间非接触相互作用的实验的示意图。本实验所用的跨井透水支护装置，由上部插入物（黄色和红色）和下部井（深灰色）组成。上部插入物的底部是一层渗透膜（红色），孔径为0.4 m，细菌无法通过（补充图2）。d在非接触共培养条件下，用透孔支撑装置研究了CF6-2菌株对MCCC0423菌株的杀灭作用。b和d中的日期是三次实验的平均标准差。源数据作为源数据文件提供。

图2 Pseudoalterin对革兰氏阳性细菌的杀灭作用。

a非接触共培养条件下CF6-2菌株分泌Pseudoalterin的检测。上面板显示细胞外弹性蛋白溶解活性。下面板显示western blot检测的Pseudoalterin产生。Pseudoalterin具有显著的弹性蛋白溶解活性，因为弹性蛋白富含Gly键15。

bΔpsn突变株和互补株Δpsn/pEVpsn的胞外弹性蛋白溶解活性。数值根据WT-CF6-2菌株的活性进行标准化。

cΔpsn突变体和互补株Δpsn/pEVpsn捕食MCCC0423菌株的能力。菌株CF6-2、Δpsn和Δpsn/pEVpsn被点接并在含有菌株MCCC0423细胞的平板上在20℃下生长3天，直到菌株CF6-2和Δpsn/pEVpsn菌落周围形成清晰的区域。

d在25℃Pseudoalterin对MCCC0423菌株细胞的时间-杀灭微生物曲线。

e Pseudoalterin对不同PG化学类型海洋细菌的杀灭活性。将细菌细胞悬浮液（OD600=0.8–1.0）在25°C下与20μg ml-1 Pseudoalterin在20 mM Tris-HCI缓冲液（pH 9.0）中孵育120分钟。革兰阳性菌为蓝色背景，革兰阴性菌为绿色背景。每个属后的上标数字表示每个属中测试菌株的数量。文中给出了每个属的PG化学型。星号显示这三个菌株的PG被细胞壁21中大量不寻常的脂质所覆盖。实心红圈表示Pseudoalterin具有杀灭活性，空心红圈表示Pseudoalterin没有杀灭活性。Pseudoalterin对各菌株的杀灭率（%）见补充表1。

f. Pseudoalterin处理MCCC0423细胞的扫描电镜观察。棒：1μm。对照，MCCC0423株细胞用缓冲液处理30min。

g透射电镜观察用Pseudoalterin处理的MCCC0423株细胞。条形图：上部为2μm，下部为500 nm。源数据作为源数据文件提供。

图3 Pseudoalterin降解PG。

a 25℃下Pseudoalterin对MCCC0423菌株PG的降解曲线。

b用AFM观察Pseudoalterin对MCCC0423菌株PG的降解。对照品，用缓冲液处理30分钟的菌株MCCC0423的PG。条：1μm

c突变菌株Δpsn和互补菌株Δpsn/pEVpsn在含PG的平板上降解PG。菌株CF6-2、Δpsn和Δpsn/pEVpsn被点接在含有菌株MCCC0423的PG的平板上20℃生长3天，直到菌株CF6-2和Δpsn/pEVpsn菌落周围形成清晰的区域。误差条表示三次试验的标准偏差。每一张图片都代表了三次实验。源数据作为源数据文件提供。

图4菌株CF6-2中Pseudoalterin的诱导和分泌。

a.用MCCC0423菌株PG诱导CF6-2菌株psn的表达。对照菌株CF6-2在无PG的培养基中培养，.

b. PG衍生肽对psn表达的诱导作用。

c. PG氨基酸对psn表达的诱导作用。

d. 不同浓度甘氨酸对psn表达的诱导作用。

e在0、6和/或12h添加2 mM甘氨酸诱导CF6-2菌株产生胞外Pseudoalterin。对照，将CF6-2菌株培养在不含甘氨酸的培养基中。Pseudoalterin的产生表现为细胞外的弹性蛋白溶解活性。

f株CF6-2的T2SS簇的遗传组织。每个基因都由一个箭头表示。群中的“核心”基因用橙色标记，其他基因（gspA、B和N）用蓝色标记。

g菌株CF6-2及其突变体在发酵培养基中的Pseudoalterin产生。上部显示Pseudoalterin的产生，表现为胞外弹性蛋白溶解活性。较低的则是western blot检测到的Pseudoalterin的产生。

h菌株ΔgspE与菌株MCCC0423的非接触共培养。上面板显示了菌株的生长。下面板显示western blot检测到Pseudoalterin的产生。图表显示了三次实验的数据（平均值±标准偏差）。源数据作为源数据文件提供。

图5 Pseudoalterin对PG的结合和降解。

a用SDS-PAGE分析了Pseudoalterin对三种不溶性多糖和PG的结合能力。实验采用固定量的Pseudoalterin（0.2mg ml-1）和增加底物浓度的方法进行。“S”和“P”分别指离心后上清液和颗粒中的蛋白质含量。BSA代替Pseudoalterin作为阴性对照。每个图代表至少三次重复。

b手性衍生高效液相色谱法分析Pseudoalterin水解MCCC0423菌株PG释放的D/L-氨基酸和肽。5aa是五种标准氨基酸（Gly、D/L-Ala、D-Glu和L-Lys）的混合物。用全自动氨基酸分析仪（日本日立L8900）对MCCC0423菌株PG中Pseudoalterin水解释放的氨基酸进行分析。数据来自三次实验（平均值±标准差）。d Pseudoalterin在菌株MCCC0423 PG上的裂解位点，箭头所示为Pseudoalterin从两种合成PG肽AaKAGGGGGA和乳酸AeKAGG释放的产物分析确定的裂解位点。红色和黑色箭头分别表示Pseudoalterin的优先键和次优先键，这是根据MS光谱中释放产物的相对生成量推导出来的（补充图。4和5）。

图6 Pseudoalterin结合和降解PG的结构基础。

a  Pseudoalterin的整体结构。C-终端域标记在黑色虚线框中。

b Pseudoalterin与LasA和lysostaphin的结构叠加。左边是前视图，右边是侧视图。Pseudoalterin结构呈绿色，LasA呈粉红色，lysostaphin呈灰色。

c MSD构建的Pseudoalterin（NAG-NAM）2二元配合物的模型。在黑点框中放大了Pseudoalterin与（NAG-NAM）2的界面。

d GST-Pseudoalterin及其C端结构域缺失突变体（ΔC，N134-R173）与PG和几丁质结合能力的SDS-PAGE分析。

e GST Pseudoalterin及其定点突变体与PG结合能力的SDS-PAGE分析。

f 利用MSD构建的Pseudoalterin:AeKaA二元配合物的模型。放大了Pseudoalterin与AeKaA在黑点框中的界面。

g利用MSD构建的Pseudoalterin: GGGGGA二元配合物的模型。在黑点框中放大了Pseudoalterin与GGGGGA的界面。

h Pseudoalterin及其突变体对PG的活性。数值以WT Pseudoalterin的活性标准化。数据来自三次实验（平均值±标准差）。

i Pseudoalterin及其突变体结合PG能力的SDS-PAGE分析。

在d、e和i中，用固定量的蛋白质（d和e中为0.1 mg ml-1，i中为0.05 mg ml-1）和底物（2.0 mg）进行实验。“C”代表蛋白质总量。“S”和“P”分别指离心后上清液和颗粒中的蛋白质含量。每个图代表至少三次重复。源数据作为源数据文件提供。

图7菌株CF6-2对D-Ala和D-Glu的利用。

a在含有2 mM D-Ala的培养基中培养的菌株CF6-2的生长曲线；

b在含有2 mM D-Glu的培养基中培养的菌株CF6-2的生长曲线。

c菌株CF6-2在2 mM D-Ala和2 mM L-Ala培养基中的生长曲线。

d CF6-2菌株在2 mM D-Glu和2 mM L-Glu培养基中的生长曲线。红线表示在600纳米处测量的细菌培养物的光密度，黑线和蓝线分别表示培养基中随时间变化的D-氨基酸和L-氨基酸的浓度。误差条表示三次试验的标准偏差。源数据作为源数据文件提供。

图8革兰氏阴性菌CF6-2以分泌的Pseudoalterin蛋白酶为武器，捕食革兰氏阳性海洋细菌获取营养物质的模型。菌株CF6-2通过分泌金属蛋白酶Pseudoalterin降解革兰氏阳性细菌细胞壁中的PG，导致细胞壁塌陷，细胞溶解。然后，菌株CF6-2利用D/L-氨基酸和PG降解释放的寡肽以及来自细胞内的物质来繁殖。同时，革兰氏阳性菌PG降解释放的富含甘氨酸和甘氨酸的寡肽诱导CF6-2菌株合成Pseudoalterin，然后通过CF6-2菌株的T2SS分泌合成Pseudoalterin。