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实验一 从特定质粒中扩增靶片段
第一部分 准备实验
一、介绍实验室的规章制度、注意事项
二、准备实验
1. 分组,分发实验服、试验用具
2. 准备枪头:装盒,灭菌(讲解注意点:戴手套操作)
3. 各个型号的EP管和PCR管的灭菌
4. 双蒸水灭菌
5. 洗净培养皿、摇菌小三角瓶、试剂瓶等
第二部分 利用PCR技术从特定质粒中扩增靶片段
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理,掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、实验原理
一)引物的设计:
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~
Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能,
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
当然,这是PCR引物设计的一般原则,随着人们对引物的认识,一些引物的计算机设计程序也应运而生,例如Primer Premier,还可以解决特殊目的的引物设计。
二) PCR原理与体系
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下:
PCR循环过程中有三种不同的事件发生:
(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1. 变性:加热使模板DNA在高温下(94
2. 退火:在体系温度降至37
3. 延伸:体系反应温度升至中温
上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。