科学史

流式细胞仪(Flow Cytometry):镏金岁月50年

李升伟/编译

[题记]自从50年前诞生至今，流式细胞仪（Flow cytometry）一直并仍然是无以伦比的高通量、高内涵的单细胞分析技术。

2015年11月，是流式细胞仪诞生50周年之时。人们可能会想象，一种如此长时间以前发明的技术应该到今天会是彻底地不同于当年，但是事实不然，它的基础原理与结构几乎没有什么改变，这一点是令人吃惊的。它可以快速地同时分析在异质性混合物内的活细胞的多种参数，此混合物作为一种流体，在光子检测器照射下产生图像；这些参数整合在一起就得出了样品的综合图像。流式细胞仪已经成为了一种主流的生物学研究工具、临床诊断学手段，其应用已经带来了数不胜数的免疫学和细胞生物学进展，并帮助人们认识了爱滋病和癌症等疾病的本质。它已经推动了大量其它重大技术的研发，其用途还在持续扩展，范围从单细胞分析到细胞群体分析。流式细胞仪是由一位电气工程师马克·福尔维勒（Mack Fulwyler）发明的，其初衷是出于对存在两种红血细胞群体的主张的争论。当时，病理学家克拉伦斯·卢斯堡（Clarence Lushbaugh）正在使用一种测量悬浮颗粒多少和大小的仪器――库特氏计数器（Coulter Counter）来鉴定红血细胞的双峰群体，福尔维勒提出其技术是不适当的。但是，对理论进行证伪的唯一途径是建立一种仪器来在群体分析的基础上物理地分离单个细胞。于是，细胞分选仪和流式细胞仪的构想就被提了出来。1964年，福尔维勒完成了对此发明的构思，并把想法写信给了当时喷墨打印机的技术发明人理查德·斯威特（Richard Sweet）。其后10个月内，他们进行了合作，构思、设计、建立和成功检测了一种细胞分选仪，并于1965年发表了有重大影响的开创性论文，对其原理进行阐述（见图）。其概念和原理是非常新颖的，以致于整篇论文只有五篇参考文献。

仅仅四年之后，该技术有了一次重大的进步。遗传学家莱昂纳德·汉森伯格（Leonard Herzenberg）使用并了解了这种细胞分选仪的威力。他与沃尔夫冈·哥德（Wolfgang Gohde）合作，将显微镜技术与流式细胞仪结合起来测量细胞关联的荧光，这给细胞分析领域带来了脱胎换骨的变化。其后不久，汉森伯格来到了剑桥大学的生物化学家凯撒·米尔斯坦（Cesar Milstein）实验室度学术假，那时候米尔斯坦和乔治·科勒尔（Georges Kohler）发明了获得诺贝尔奖的单克隆抗体技术。汉森伯格认识到，这些新的、特异性抗体可以用荧光染料进行标签化处理，可以对异质性混合物内的细胞进行选择性标记。他的实验室很快就研发出了数十种单克隆技术来区分白血细胞的子集，从而建立起一份免疫细胞类型的字典。流式细胞仪不仅使得多参数数据得以收集，还使得细胞在存活的情况下，同一时间地分选成为不同的细胞群体，成为所谓的“荧光激活细胞分选”（FACS，fluorescence-activatedcell sorting）。

图注：流式细胞仪原型.马克·福尔维勒在1965年发表了第一台流式细胞仪的构思图，提出其可以“同时测量一个细胞的两种（或者更多）特征，并根据这些特征的比例进行细胞分离。”

20世纪70年代中期，流式细胞仪进入了分子生物学领域，遗传学家约瑟夫·格雷（Joseph Gray）研发出了流式染色体核型分型技术，可以在2分钟内（而不是几小时）评估出染色体的数量和外形来，还可以分选出单个的染色体来。该技术还扩展到了DNA和RNA内容物的研究，使之进入了细胞分裂周期分析和程序性细胞死亡（凋亡）的研究，在当时是全新的领域。更高内涵分析的持续驱动，促进了荧光染料的研发，如德克萨斯红（后来成为了亚历克斯染料）和花青染料，它们所形成的试剂市场目前已经超过了每年10亿美元。便宜的紫色激光的出现，开始是一种低成本蓝光光碟的副产品，后来形成了亮丽的紫色染料。量子点技术将光线转换成为可见光谱系内差不多任何颜色，并保持高度的效率，目前也常见应用于流式分析中。能够对每个细胞进行同时测量的数目，已经从20世纪70年代的1个或2个参数，增加到了今天的30个参数，这使得下一代高参数流式细胞仪竞争性地融合了细胞仪飞行时间技术（CyTOF）。2011年，CyTOF和质谱仪的结合形成了超高内涵流式细胞仪，其中，用金属缀合探针对各种抗体进行标记。这种技术步骤更加复杂、通量不够高，但是如同FACS一样，其技术持续进化中。

今天，一系列分析化学及其仪器都被用于流式细胞仪中。测量的候选物包括干细胞和癌症细胞的生物标记物、核酸、活性氧簇、微囊泡、甚至是酵母或细菌的功能状态。可能该技术最引人注目的发展还是在其临床细胞仪中。近来，在一些临床实验室中已经变得标准化的是同时用10种或更多种荧光染料进行操作，这种临床市场大小现在超过了10亿美元。

 用流式细胞仪进行细胞分选的工作已经长期地成为了生物医学研究的一种核心工具，同时，它还很快地成为了其它生物学领域的一种标准技术。例如，在畜牧业中，它通过改进、被使用来分选精子以用于动物性别选择，使动物配种形成一种全商业化的产业。在环境科学中，它已经被用来从复杂的微生物群落中分离以前不知道的生物体。流式细胞仪还在构建新的研究领域。它的大数据获取能力打开了机会，可以建立基于高速度机器人和尖端分析化学的化学分析，并开发出群体分析的分类技术。作为一种财富和资源，数据的增长还支持对生物学过程的系统生物学认识，这形成了对尖端信息学发展的需求。事实上，目前对流式细胞仪的挑战包括非常高内涵数据分析的标准化和与日俱增的复杂性。

今后的发展方向是怎样的呢？下一代仪器现在能够在细胞分选时得到非常高分辨率的细胞成像。还有基于声学的分选，使用超声辐射压来集中细胞进入流体内，当样品是低细胞浓度的时候可以得到令人满意的结果。这一进步重新打开了在高速度条件下进行细胞周期分析的机会。光谱细胞计数仪（Spectral cytometry），应用全部的荧光发射谱系对每个细胞进行测量，得到独特的细胞“指纹”，可以对荧光染料组合物的高度复杂混合物进行分离。拉曼散射流式细胞仪可以实时地根据细胞的化学状态对细胞进行分选。大量的在微型化和微流体学方面的努力也在进行之中，这方面的改进目标是为了无菌条件下进行（细胞）移植而进行高通量细胞分选。极端高通量的基于微流体学的细胞分选将预示着50年发展史中基础硬件的第一个重大革命。目前在流体细胞仪市场上有100多家公司，组成了超过30亿美元规模的产业。流体细胞仪普遍应用于研究和临床医学领域，这项技术在生物学医学领域的应用是任何其它技术无法媲美的。流式细胞仪50年的发展史证明，吹尽黄沙始到金，流式细胞仪，货真价实地是好东西。

注：原文作者J.保罗·罗宾逊（J. Paul Robinson）是美国普渡大学韦尔登生物医学工程学院基础医学科学系主任，马瑞欧·罗伊德勒（Mario Roederer）供职于美国国立卫生研究院国立变态反应与传染病研究所疫苗研究中心。

[资料来源：Science 13 November 2015,350(6262): 739-740]

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