BMC Biology泛癌早筛新成果：思勤医疗

系统展示cfDNA fragmentomics最新研究成果

李升伟   张  毅   茅  矛

（思勤医疗科技有限公司，广东深圳；特趣生物科技有限公司，广东深圳）

2023年11月13日，BMC - Part of Springer Nature旗下顶级期刊《BMC Biology》在线发表了思勤医疗最新研究成果《Circulating cell-free DNA fragmentation is a stepwise and conserved process linked to apoptosis（循环cfDNA片段化是一种与凋亡关联的逐步化和保守性过程）》。位于广东深圳的生物技术公司--思勤医疗科技有限公司，联合上海交通大学附属瑞金医院、北京大学深圳医院、中山大学孙逸仙纪念医院、河南省肿瘤医院等团队在《BMC Biology》（JCR 1区,影响因子5.4）上共同发表了关于循环游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）片段化形成机制的最新研究成果。思勤医疗创始人茅矛博士和上海交通大学附属瑞金医院周隽教授为共同通讯作者。

该研究创新性地将凋亡细胞内形成的DNA片段与血浆中的cfDNA片段联系起来，采用全基因组低深度测序（shallow whole genome sequencing，sWGS）分析cfDNA片段化的生物学过程。指出哺乳动物的cfDNA图谱存在特殊性和保守性，为cfDNA的片段组学的应用提供了新的见解，通过对比人类cfDNA片段化图谱的差异，为cfDNA片段组学的应用提供了新的见解，将有助于人类/犬类癌症的早期诊断和癌症进展期间的监测，是思勤医疗在癌症早筛与监测研究中的又一重大突破。

文章链接：https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-023-01752-6

研究设计

研究首先以人类造血细胞株HL60为模型进行细胞凋亡试验，结合sWGS技术分析HL60细胞凋亡的cfDNA片段化过程。然后对901名健康人、38只犬以及438名癌症患者（癌症类型为6种常见癌症：乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、胃癌）的血浆cfDNA片段进行对比分析。

主要研究结果

1. 凋亡细胞的cfDNA片段化有两个步骤，在片段分布的不同位置形成主峰和次峰

研究首先以HL60细胞为模型，剖析cfDNA片段化的生物学过程。在不同条件下诱导细胞凋亡（血清饥饿（SS）、高密度（HD）、室温（RT）、凋亡诱导剂（CPT）），都发现了相似的凋亡DNA条带，DNA条带由一个、两个、三个、四个和多个核小体单位组成（图1 A）。这表明染色质片段化是细胞凋亡的特征。

RT诱导的HL60细胞凋亡会产生明显的梯状DNA条带（图1 A），因此进一步研究了不同时间点RT诱导的HL60细胞。结果显示，随着细胞的凋亡，DNA片段的条带越来越明显（图1 B）。
  然后以高分辨率的sWGS（1×）分析HL60凋亡细胞的片段大小分布。结果表明，cfDNA片段大小分布的峰值主要位于~167 bp、~360 bp、~540 bp和~720 bp处（图2 A），分别对应一、二、三、四个核小体单位。
对HL60细胞上清液中cfDNA片段进行检测，发现了一系列明显具有10 bp周期性的峰（图2 B）。进一步的研究表明10-bp周期性的峰是由核小体产生的（图2 C）。
  综上，凋亡细胞中的cfDNA片段化过程包括细胞内和细胞外的消化。细胞内的核小体以一个、两个、三个、四个和多个核小体单位被剪切，细胞外的核小体被分解为10-bp周期性亚核小体片段，在cfDNA片段大小分布中分别表现为主峰和次峰（图2 D）。

图1 cfDNA片段化与细胞凋亡密切相关

图2 cfDNA片段化的过程

2. 哺乳动物的血浆cfDNA图谱具有独特性和保守性

通过sWGS技术对901名健康人类个体的血浆样本进行检测，发现cfDNA片段的主峰出现在167 bp（85.0%）处，另外三个峰值分别位于333 bp（12.1%）、527 bp（2.3%）和719 bp（0.4%）处，这分别表示单核小体、二核小体、三核小体和四核小体（图3 A，C）。除了四个主要峰外，还同时观察到明显的片段化特征，即10-bp周期性的小峰（图3 B）。
  此外，还分析了血浆cfDNA片段5′末端序列的碱基含量比例。在cfDNA片段的5'末端的第一和第二碱基处都存在C-end富集现象（图3 D），这与小鼠中的发现一致^[1]，并且在第一主峰（50–250 bp）的cfDNA片段也倾向于C-end（图3 E）。进一步分析了来自38只健康犬的血浆样本，发现cfDNA分布图谱与人类基本一致（图3 F-J）。同时，有研究发现，在小鼠血浆中也存在相似的cfDNA片段化图谱^[1]。

  由此得出，cfDNA片段化图谱在哺乳动物中具有独特性和保守性。

图3 901名健康人和38只犬的血浆cfDNA片段特征

3. 癌症患者cfDNA片段化特征与健康个体截然不同

研究对438名六种癌症类型患者的血浆样本进行sWGS分析。分析结果表明，与健康人相比，癌症患者中检测到的血浆cfDNA含量普遍较高（图4 A）。
为了更好地区分癌症和正常血浆中cfDNA图谱（图4 B），该研究建立了一个quantitative proxy，分别对11个最明显的周期性峰值进行评估。结果显示，除了50 bp的峰值外，与健康组相比，癌症组其他峰值的reads百分比均显著高于健康组（图4 C，D）。
  研究还发现，癌症患者样本中倾向于C-end的cfDNA片段也显著减少（图4 E），这与Jiang等人^[2]在肝癌中的发现一致。
  基于这些观察结果可以得出，健康个体与癌症患者的cfDNA图谱存在明显差异。

图4 癌症患者的明显特征

结 论

本研究以HL60细胞为模型，将凋亡细胞释放的DNA片段以电泳条带的形式呈现，并与血浆中的cfDNA片段联系起来，利用sWGS技术剖析cfDNA片段化过程：在细胞内以（一、二、三、四个）核小体单位被剪切，然后在细胞外被分解为一系列10-bp周期性片段，在cfDNA片段分布中表现为主峰和次峰。然后，利用sWGS分析了人类和犬类的cfDNA片段化特征，发现哺乳动物中的血浆cfDNA图谱具有一定独特性和保守性，同时，健康个体和癌症患者的cfDNA片段化特征存在显著差异。因此，cfDNA片段化可以作为一个特异性的癌症指标，用于癌症信号的分析。
  目前，思勤医疗已经将这一研究成果成功应用于思康宁（SeekInCare）®、思康安（SeekInCure）®、思康明（SeekInClarity）®等三款产品，助力癌症早期筛查与监测。同时，特趣生物已经将这一研究成果成功应用于中国首款宠物癌症早筛产品宠可欣（PetCanSeek）®，以更高精度非侵入性地检测更多的癌症类型，助力犬类癌症早筛。

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思勤医疗

思勤医疗是一家2018年成立于深圳的高科技生物技术公司。2023年由工信部授予国家级专精特新“小巨人”企业称号，被认证为业内创新能力强、市场占有率高、掌握关键核心技术、质量效益优的排头兵企业。

创始人茅矛博士，师从著名的血液学和遗传学专家王振义院士和陈竺院士，是上海国家人类基因组中心创始成员，具有30多年临床、遗传学、基因组学及药物研发经验。美国FDA批准的乳腺癌预后判断试剂盒MammaPrint（世界上第一个癌症基因组学检测方法，2007年获批）的发明人之一；他发现的 RIG-E 基因，被称为是“中国克隆的第一个人类新基因”，是基因和健康数据共享的倡导者。在他的带领下，思勤医疗秉承“真理至上，以人为本”的信念，致力于为癌症早期筛查、术后复发监测、疗效评估，以及血液肿瘤的诊断与预后提供独特而更加有效的解决方案。

思勤医疗拥有自主知识产权核心技术壁垒，已获得多项发明和外观专利授权，旗下的六款主推产品已通过欧盟CE认证。公司与国内外多家顶级医院展开了数项临床科研合作，共同攻坚亟待解决的临床需求与挑战。

思勤医疗在国际上引领全新泛癌种癌症早筛理念和方法，以扭转中晚期癌症群体的命运结局，使得受检人群的癌症死亡率在2030年前减少15%。

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深圳特趣生物科技有限公司（简称“特趣生物”）是思勤医疗的关联企业，公司以更好地服务广大养宠家庭，满足中国宠物健康领域对宠物健康的市场需求为己任，致力于改善传统宠物癌症检测手段的繁琐，优化宠物与宠物主的就医体验，提升宠物泛癌种检测的专业水平。特趣生物在国际上引领全新宠物泛癌种早筛的理念和方法，帮助狗狗的癌症能被更早地发现，让它们能与家人一起享受健康生活。

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附件（全文）：

Zhu et al_2023_Circulating cell-free DNA fragmentation is a stepwise and conserv.pdf