朝花夕拾：

用结构生物学方法抗击SARS-CoV-2病毒

编译　李升伟  茅  矛

（特趣生物科技有限公司，广东深圳）

　　[题记]高分辨率结构信息对于针对新出现的人类病原体的疫苗和疗法的快速开发至关重要，自新冠肺炎大流行开始以来，结构生物学方法一直处于研究SARS-CoV-2病毒的前沿，这些技术将一如既往地为抵御未来公共卫生威胁提供有力工具。

　　自从第一个病毒颗粒和病毒糖蛋白的原子结构发表以来，40年已经过去了。流感病毒血凝素结构研究成果已成为病毒糖蛋白结构研究不可缺少的参考文献，同样重要的结构研究还包括人类免疫缺陷病毒1 (HIV-1)包膜糖蛋白和冠状病毒刺突蛋白的研究，它使免疫学家能够在三维结构上可视化人类病原体的抗原性，而抗原表位作图是原子模型的第一个主要应用。在确定结构的一年内，膜融合机制的轮廓开始成形。流感神经氨酸酶的结构研究也成为了至今仍在使用的药物开发的范例。然而，结构生物学总体上落后于其他方法——遗传学、细胞生物学、分子生物学和生物化学—— 为了认识病毒和病毒感染性，在纯化的生物学组装样本中定义数千甚至数十万个原子的三维坐标一直是一项耗时且具有挑战性的任务。在当前的新冠肺炎大流行期间，我们对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2病毒)的结构了解取得了快速进展，结构生物学方法在其中取得了重要成就。

　　生物大分子在原子分辨率水平的结构测定主要依赖于结构生物学中的三种主要方法：X射线晶体学、核磁共振波谱学(NMR)和冷冻电镜术(cryo-EM)。X射线晶体学对有序晶体的需要和核磁共振分子量的上限排除了许多大分子及其复合物，构成了机械认识论的关键，推进了这两种方法的应用。自2013年以来，冷冻电镜单颗粒分析的发展使电子显微镜能够达到很高的分辨率，极大地改变了结构生物学景观。由于新技术和软件的发展，冷冻电镜技术需要的样品比晶体学或核磁共振(数毫克或更多)需要的少得多(~0.1毫克)，已成为在原子分辨率或接近原子分辨率情况下测定生物大分子结构的有力工具。首先，直接电子探测器的引入大大提高了记录图像的探测效率(从而增强了对比度)，超过了传统电荷耦合器件(CDD)探测器和摄影薄膜所能提供的水平，有效地保存了高分辨率信息。第二，新的探测器使电影模式的数据收集成为可能，它可以校正光束诱导的样本运动，允许对计算图像进行去模糊。第三，最大似然算法实现了稳健的三维分类，将成分或构象不均匀的样本分离为结构同质化的子集，可以产生比以前更高的分辨率的密度图。

　　然而，将生物大分子从其细胞环境中移除，可能会妨碍对其在原生环境中的功能的完整认识。低温电子断层扫描术(cryo-ET)能够以足够的分辨率进行原位结构性成像，实现了高分辨率结构研究，这些结构来源于一个隔离样本，同样的分子来源于复合体和异构组装体内，如SARS-CoV-2病毒颗粒，甚至在一个完整的细胞内。Cryo-ET通过记录倾斜序列(例如，±60°)的投影图像，并通过计算将其重构为3D断层扫描，以纳米范围内的分辨率重建感兴趣的靶标及其周围环境的分子3D图像。电子吸收将样品厚度限制在约500纳米以内——比大多数病毒颗粒的尺寸大，但比真核细胞的几乎所有部分都薄。聚焦离子束(FIB)研磨与相关光电子显微镜术(CLEM)结合有助于解决这一问题。在细胞中铣削一个薄的(例如150-200纳米)“薄片”，可以提供一个窗口，让我们看到包含在该薄层中的细胞部分。重构层析图像可以直接用于结构解释，但由于复杂的细胞背景和层析图像本身低信噪比，很难从单个细胞内颗粒中提取高分辨率信息。如果在一个细胞中存在许多颗粒的拷贝，将从层析图中提取的这些颗粒的图像平均化(亚层析图平均化)可以极大地扩展分辨率，在有利的情况下甚至可以接近原子的细节。

自2019年新冠肺炎首次爆发以来，新冠病毒一直受到科学界的关注。在第一个病毒基因组序列公布后，对各种病毒成分以及整个病毒的结构研究以惊人的速度得到推进。仅仅两周后，病毒复制的关键酶——主蛋白酶(ProM)的晶体结构就被储存在了蛋白质数据库(PDB)中供科学家们使用，随后很快又发表了几种刺突(S)蛋白复合体的结构。这些包括有融合前构象稳定的外结构域的冷冻电镜结构和受体结合域(RBD)与受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)复合的X射线晶体结构。 S蛋白介导病毒与靶细胞膜融合，使病毒进入宿主细胞。它也是诱导中和抗体应答的主要表面抗原，因此是第一代疫苗的关键组分。基于之前在冠状病毒和HIV病毒领域的研究，该策略以两个脯氨酸残基稳定S-融合前构象，以防止融合后结构形成长螺旋，已被用于几种成功的新冠肺炎疫苗。在稳定的外结构域结构报道后不久，也报道了原始武汉-胡-1菌株纯化的全长S蛋白的融合前和融合后结构，以及携带D614G单残基替换的早期变体的全长S蛋白的结构。这些结构与低温电子断层扫描术亚层析平均和冷冻电镜单颗粒分析对化学灭活的SARS-CoV-2病毒颗粒的研究结果一致，表明使用D614G取代未修饰的武汉- 胡-1株S序列的免疫原可能具有更大的稳定性。许多单克隆中和抗体与S蛋白复合物的结构也已确定。这些结构不仅有助于对抗体中和机制的理解，而且可以指导开发和优化治疗性抗体的合理策略。

 图1：SARS-CoV-2病毒的关键结构。

　　a，来自早期变体的全长S蛋白的Cryo-EM结构，在闭合融合前构象中携带单残基替换(D614G)，所有三个RBD在向下构象中(EMD-23010; PDB ID: 7KRQ)。 S三聚体中的三个原聚体分别用红色、绿色和蓝色表示。b，完整的SARS-CoV-2 (EMD-30430)的Cryo-ET重建，刺突和RNP组合体都显示出来了。 c，SARS-CoV-2病毒RdRp酶的冷冻电镜结构，包括nsp12(红色)、nsp8(绿色)和nsp7(蓝色)，以及RNA模板产物双链(黄色和青色)的两圈(EMD-11007; PDB ID: 6YYT)。d, SARS-CoV-2病毒ProM酶二聚体与抑制剂(N3)复合物的晶体结构，两个原聚体分别为带状图(绿色和青色)和球形模型抑制剂(PDB ID: 7BQY)。e, SARS-CoV-2病毒PLpro与肽抑制剂(VIR251)复合物的晶体结构。酶用丝带图(绿色)表示，抑制剂用球形模型表示(PDB ID: 6WX4)。f，固态核磁共振测定SARS-CoV-2病毒E蛋白跨膜结构的五聚体组装(PDB ID: 7K3G)。原聚体分别用红色、品红、黄色、蓝色和绿色表示。

　　随后，通过低温电子断层扫描术和亚层析平均分析SARS-CoV-2病毒的整体分子架构，显示了病毒颗粒表面中等分辨率的融合前和融合后状态的S蛋白结构，以及病毒膜内核糖核蛋白(RNPs)的组装(图1b)。病毒复制机制的关键组分是RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，既可进行复制也可进行转录。SARS-CoV-2病毒RdRp酶的低温电镜结构，包括非结构蛋白12 (nsp12)、nsp8和nsp7，以及RNA模板-产物双链的两圈(图1c)，展示了酶如何与双链RNA相互作用，以及抗病毒化合物如何靶向酶。 SARS-CoV-2病毒内ProM的晶体结构(图1d)和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(PLpro, nsp3; 图1e)与各种抑制剂的复合物说明了抑制机制，并指导了重新利用已批准药物、开发新疗法的努力。核磁共振波谱学也为我们对某些病毒成分的结构理解做出了重要贡献，特别是那些隐藏在膜中的病毒成分，这些成分很难通过其他方法获得。例如，包膜(E)蛋白形成了一个对病毒致病性至关重要的同源五聚体阳离子通道。固体核磁共振波谱确定的E跨膜结构域(图1f)，可能有助于E抑制剂作为抗病毒药物的开发。同样，由于在cryo-EM或cryo-ET测定的S结构中，它要么被去除，要么不可见，因此S蛋白的跨膜结构域被分离并重组为模拟脂质双分子层的双细胞，用于液体核磁共振的结构测定。该结构是一种具有四分体重复的新型三聚亮氨酸-异亮氨酸拉链。截至2022年2月，PDB中已储存了1832个含有SARS-CoV-2成分的结构，其中1195个通过X射线晶体学测定，628个通过电镜测定，8个通过液体NMR测定，3个通过中子衍射测定，1个通过固体NMR测定。此外，强大的分子模拟工具已被应用于推断SARS-CoV-2感染步骤的动力学机制，如膜融合所需的S蛋白的大构象变化，远远超过静态原子结构所能提供的。

　　我们坚信，结构生物学将继续做出关键贡献——不仅在努力控制新冠肺炎大流行，而且在抗击未来任何人类病原体暴发方面—— 通过揭示感染、发病机制和宿主免疫反应的原子细节，以及促进疫苗和治疗策略的快速发展。特别是cryo-EM和cryo-ET技术的进步在过去的十年里大大拓展了研究范围，使得多种生物样品可以通过高分辨率结构生物学方法进行研究，因为它不再是必要截断全长蛋白质，消除生理相关翻译后修饰(例如, 糖基化)，或选择一种均质构象以产生衍射良好的晶体或可解释的核磁共振谱。几年前，像SARS-CoV-2病毒的刺突那样含有1000多个氨基酸残基的全长重链糖基化蛋白的原子结构在不到三个月的时间内就能确定是不可想象的。

　　其他技术进步也对结构生物学领域产生了重大影响。例如，活细胞光学成像，结合基于深度学习的数据分析的晶格光片显微镜，已经在活细胞的背景下实现了前所未有的单分子水平的空间和时间分辨率。基于深度学习的程序AlphaFold和RoseTTAFold预测的蛋白质结构现在已经变得非常准确，这代表了结构生物学的进一步重要进展，因为它们可以在蛋白质组学水平上快速生成原子模型(包括一些SARS-CoV-2病毒蛋白)，不仅可以指导功能研究， 也可以作为实验方法确定结构的初始模型。这些进展彻底改变了我们研究生物过程(如病毒感染)的分子事件的方式，标志着结构生物学的新时代，它直接将静态原子模型与拥挤的细胞环境中的动态事件联系起来。

　　结构生物学的下一个方法论挑战是什么?在冷冻电镜中，从低温网格中最初选择的大多数颗粒都被视为“垃圾”，即使是在生化“干净”的制备中，也会被拒绝，因此从后续的数据处理中删除，以过滤出少数“好的”类别，这些类别足够均匀，足以进行足够的对齐，以达到高分辨率。目前还不清楚这些“坏”颗粒是否确实是错误折叠或损坏的分子(例如，由于有充分证据证明的空气-水界面变性)，还是仅仅是在低丰度下具有生理意义的物种，或具有难以对齐的固有构象动力学。有可能某些重要的结构信息随着真正受损的颗粒一起被丢弃。Cryo-ET是电子显微镜技术中一个快速发展的前沿领域，在分辨率方面仍有很多需要实现的地方。此外，在许多cryo-ET重建中，嵌入膜中的小区域是不可见的，尽管如果收集到足够多的X线断层照片，应该有足够的对比度来揭示它们，至少在理论上是这样。最后，尽管基于人工智能的程序(如AlphaFold)已经在结构预测方面发挥了强大的作用，但高水平的准确性仍然严重偏向于那些在训练过程中通过实验方法确定的同源模型。预测具有配体或翻译后修饰的大型复合体蛋白质的结构仍然是一个巨大的挑战。

    结构生物学已经成为理解生物学和医学不可或缺的工具，并继续迅速发展。如果一个完整的病毒颗粒的原子图像是未来任何可与新冠肺炎大流行相提并论的大流行开始时发布的首批结果之一，我们不应感到惊讶。

[资料来源：Nature Methods]

原文链接: Fighting SARS-CoV-2 with structural biology methods | Nature Methods  https://www.nature.com/articles/s41592-022-01448-9