瑞士光源（SLS）蛋白质晶体线站负责人WangMeitian教授来访—展示Native-SAD phasing技术

作者：崔胜

        寒假将至，崔胜课题组有幸邀请来自瑞士保罗谢尔研究所-瑞士光源（PaulScherrer Institute – Swiss Light Source）的蛋白质晶体学X射线衍射实验线站的负责人Wang Meitian教授进行学术交流活动。Meitian为我们详细讲述了X射线晶体学新方法Native-SAD的原理和应用，让我们受益匪浅。

       众所周知，“相”问题（phase problem）是困扰X射线晶体学研究核心问题。X射线晶体衍射技术解析生物分子结构的原理基于X射线“波”的本质。利用傅里叶转换（fourier transformation）可以将生物大分子晶体衍射产生的“倒空间（reciprocal space ）”转换成“实空间（real space）”的电子云密度图，从而实现蛋白质原子的建立。然而，现有的X射线探测器技术可以测量X射线光强度却不能获得相的信息，因此致傅里叶转换计算无法进行。人们发明了各种方法获取相的信息。目前，比较常用的方法包括了基于重原子的异常散射的SAD/MAD-phasing和基于同源结构的分子置换（molecular replacement）。进行SAD/MAD-phasing需要制备含有重原子的蛋白质晶体衍生物。这个过程往往需要耗费巨大的工作量和不可预计的时间。基于同源结构的分子置换需要找到与被解析结构高度相似的分子模型，然而这种方法对于全新结构、全新构象的解析是无能为力的。

      利用蛋白质中天然存在原子的异常散射获得相的信息显然是解决相问题的理想方法（Native-SAD）。生物大分子中广泛存在硫，磷等元素，分别来自蛋白质中的半胱氨酸，甲硫氨酸和核酸中构成骨架的磷酸基团。这些原子等均可提供异常散射信号。利用较低能量同步辐射光源（1.7-2.0Å）能够测量硫或磷元素异常散射信号。由于这一波长范围并不是硫或磷的吸收峰值，这些原子能提供的的异常散射信号非常微弱（Z<20）。正是基于这种原因，截止到2014年以前，PDB数据库中仅有91个通过Native-SAD完成的晶体结构，而基于其他重元素SAD-phasing解析的结构已达到了7163个。

      2014年以来，Native-SAD技术发生了革命性的改进。许多的晶体结构通过Native-SAD获得解析，许多长期困扰研究者难以解析的晶体结构却意想不到的通过Native-SAD迎刃而解。Native-SAD成功应用归功于一系列技术的瓶颈的突破。首先，同步辐射实验线站针对Native-SAD数据收集的特点和需求进行了特殊仪器设备的研发。例如，普通同步辐射线站配备单轴角度仪（Goniometer）。在衍射实验中晶体仅能在围绕phi轴旋转。多轴旋转的晶体数据收集策略有利于测量衍射盲点并提高数据的完整度，因此对于收集弱异常散射数据非常有利。但多轴角度仪通常在小型实验室光源中使用（kappa goniometer），却很少出现在同步辐射线站。经过多年的努力，Meitian教授在SLS的X06DA线站成功研发并安装了高精度多轴角度仪，命名为“PRIGo”。PRIGo能够精确定位晶体，在不同chi角连续收集衍射数据，获得高冗余度数据。Meitian教授通过大量的X射线衍射实验发现多轴数据收集与单轴数据收集相比有显著降低系统误差的优势，为Native-SAD phasing提供了极大的便利条件。使用X06DA的PRIGo多轴衍射数据收集装置进行Native-SAD phasing，Meitian教授在1年多的时间里完成11个晶体结构的解析，其中既包括了分子量最大为260kDa多聚蛋白复合物晶体结构，又包括了衍射分辨率为3.0Å的低分辨率晶体结构。其次，X射线探测器（Xray detector）技术为弱异常散射数据收集提供了第二个有利条件。在SLS研发的PILATUS（Dectris）探测器属于新一代像素阵列探测器。与传统的CCD探测器比较，像素阵列探测器具有零读出、零暗电流噪音，快速读出时间和高动态范围等物理特性优势。这些优势使fine phi-slicing的衍射数据收集策略成为可能。实验证明，这种数据收集方式不但可以提高衍射数据的质量，而且可以优化弱异常散射的信号强度。

      近年来Native-SAD技术不断成熟并得到广泛应用。这是晶体制备方法优化，实验线站设备升级和数据收集方法改进等因素共同作用的结果。与上世纪80年代第一个Native-SAD成功案例相比，现在进行Native-SAD phasing的“门槛”已经大大降低。Meitian教授给大家提出了一般原则，即如果蛋白质中每50氨基酸中含有1个半胱氨酸或甲硫氨酸，蛋白质晶体衍射分辨率最低在3Å左右都可以尝试Native-SAD phasing。如果用这个“门槛”来衡量保存在PDB数据库中所有的晶体结构，至少>90%的晶体适合Native-SAD phasing。 换一句话来讲：按照以往的经验，人们在获得蛋白晶体的时候会首先尝试重原子衍生晶体的制备以获得相问题的解决。而现在，Native-SAD技术使人们可以直接选择天然晶体定相，便可迅速获得晶体结构的解析。