志贺氏菌毒力基因调控机制—从染色体、质粒分配到转录调控

在现代社会中，细菌性痢疾仍然是全球公共卫生安全面临的重大威胁之一。在发展中国家，细菌性痢疾的危害尤为严重。志贺氏菌属于革兰氏阴性杆菌，是导致细菌性痢疾的首要病原体。细菌性痢疾每年造成数十万人死亡，尤其对儿童的威胁最大^[1]。福氏志贺氏菌是引起细菌性痢疾的主要病原体之一。在过去十几年中，我国流行的福氏志贺氏菌优势株为福氏2a 301株。然而，最近我国科学家研究表明，新发现的福氏Xv志贺氏菌已经成为我国流行的优势菌株^[2][3]。在以往的研究工作中，我们于2001年完成了福氏志贺氏菌2a301株的全基因组序列测定，是我国首个独立完成的微生物基因组项目，为志贺氏菌的致病机理研究提供了完整的遗传背景信息^[4]。

志贺氏菌的基因组序列与大肠杆菌高度同源，其致病性主要基于细菌中约230Kb的侵袭性大质粒。志贺氏菌的毒力基因集中分布在侵袭性大质粒中约31Kb的“entry region”中。这些毒力基因编码了三型分泌系统（T3SS）的效应蛋白、结构蛋白、调控蛋白及伴侣蛋白等大量蛋白质。志贺氏菌感染引发的细胞内病理变化和细菌性痢疾的临床表现正是由于T3SS大量的细菌毒力蛋白综合作用结果^{[5] [6]}。毒力基因的表达无疑为细菌造成巨大的代谢负担。因此，在进化的过程中，志贺氏菌形成了一个精巧的毒力基因转录和表达调控体系，由来自侵袭性大质粒的调控系统和来自细菌基因组编码的全局调控系统共同组成。志贺氏菌只有在特定的环境信号的刺激下（如中性的pH值和生理温度等），侵袭过程才能够启动^[5]。

在不适宜的环境条件下，志贺氏菌的毒力基因的表达受到抑制。染色体编码的H-NS蛋白通过结合毒力基因启动子附近的AT富集区形成转录抑制复合物，阻止RNA聚合酶向启动子下游移动，从而在转录水平抑制毒力基因表达。在适宜环境因素的诱导下，即温度、pH值和渗透压等环境参数与小肠内环境接近时，志贺氏菌毒力基因的转录开始被激活。毒力基因的激活通过一系列级联调控步骤实现，首先包括了virF基因的转录激活，其产物VirF蛋白继而激活virB基因的转录，造成VirB蛋白的表达上调，VirB蛋白能够特异性结合位于毒力基因启动子上游的DNA顺式作用位点（cis-acting site），从而解除H-NS介导的转录抑制作用^[7]。最终导致位于侵袭性大质粒上的各种毒力基因转录的全面激活，引发志贺氏菌的侵袭。

VirB蛋白核心结构域（VirBcore）与毒力基因上游DNA顺式作用位点复合物晶体结构的解析为理解志贺氏菌转录调控机制迈出了坚实一步^[8](图1)，晶体结构显示VirB蛋白核心结构域直接结合毒力基因顺式作用位点DNA双螺旋结构的“大沟”（majorgroove），决定了VirB蛋白识别序列的特异性。此研究结果填补了国际科学界对VirB蛋白识别DNA的猜测和印证。VirB蛋白核心结构域（VirBcore）与DNA的晶体结构及其结合DNA的生物化学和生物物理学的特性进一步揭示了VirB蛋白解除H-NS蛋白抑制毒力基因转录的初步分子模型，即VirB蛋白通过C-端结构域发生寡聚化，形成VirB的多聚体。VirB通过核心结构域准确定位到启动子上游的顺式结合位点，造成DNA双链在顺式作用位点处发生弯曲；DNA的弯曲进而引起下游DNA结合到VirB多聚体的其他DNA结合位点；最终造成DNA在VirB多聚体上的缠绕。VirB诱导的DNA构象变化可破坏H-NS-DNA转录抑制复合物的稳定性，释放RNA聚合酶复合物，激活毒力基因的转录^[8]（图2）。

然而，细菌的转录调控是一个复杂的系统过程，目前对志贺氏菌毒力基因激活的分子机制的了解仅仅是冰山一角，现有的知识不足以解释VirB蛋白如何实现基因的全局调控。比如，VirB蛋白可以在目的基因上游几千bp处实现基因的转录。这种现象是如何发生的呢？现有对VirB结构的信息和功能的研究不足以解释该现象。目前的猜测认为VirB通过桥接机制引发DNA的构型发生巨大转变从而解除H-NS的抑制。这种猜测主要基于以下理论研究，首先，VirB蛋白可以特异和非特异的结合DNA，从而在DNA上形成纤丝^[8]，这与其同源蛋白ParB蛋白类似，各种ParB分子集结在染色体DNA上从而形成高聚物有利于下一步的质粒分离。其次，序列分析比较发现，VirB蛋白N端结构域含有“RRLR”精氨酸簇，此簇高度保守。最近对质粒分离蛋白ParB家族spo0j研究表明^[9]，spo0j通过其多变的N端参与分子间的相互作用和高度保守的HTH结构域参与parS结合从而形成长形状的分子结构。spo0j通过其N端可以水平和垂直的与邻近分子作用从而形成高聚体。这种作用主要通过其高度保守的精氨酸簇。这种作用对其形成高聚物和ParB的播散至关重要。最后，体内单分子研究表明，spo0j可以使DNA形成环。对精氨酸簇突变（RRLR）研究表明其完全破坏了DNA桥。以上研究解释了为什么有限的spo0j（每个parS位点只有20个分子）分子可以跨越几千bp从而利于parB分子装载SMC复合物参与了染色体的分离^[10]。

因此，DNA桥接是多种parB同源物的共同特性，志贺氏菌VirB蛋白可能具有相同的特性，这也暗示了其进化的保守型。鉴于以上的分析比较parB和VirB,我们可以认为和推测尽管VirB与parB功能不同，但是保持了parB祖先的特有功能即DNA的结合和DNA桥接。因此，对于VirB蛋白N端结构域的结构解析及与DNA复合物结构的解析，进而对VirB全长蛋白以及与DNA复合物结构的解析将终结这些猜测。最终通过体内外单分子研究将进一步阐释VirB蛋白如何在宏观层面调节DNA，在体内如何调节毒力大质粒的分子机制。此研究将深入揭示质粒分离蛋白如何进化为毒力转录的分子机制。

PDB:3VWB

       图.1.VirB蛋白核心结构域与目标启动子DNA的晶体结构^[8]

图.2. VirB蛋白拮抗H-NS转录激活机制初步模型^[8]

发表SCI论文链接：http://nar.oxfordjournals.org/content/41/22/10529.long 

参考文献

1      Bardhan, P., Faruque, A., Naheed, A. & Sack, D. Decrease inshigellosis-related deaths without Shigellaspp.-specific interventions, Asia. EmergingInfect. Dis. 16, 1718-1723 (2010).

2      Ye, C.et al. Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemicclone of Shigella flexneri. Journal of Clinical Microbiology 48,419-426 (2010).

3      Zhang, N. et al. A genomic portrait of evolution and epidemic spread of arecently emerged multidrug resistant Shigellaflexneri clone in China.Journal ofClinical Microbiology, doi:10.1128/jcm.02669-13 (2014).

4      Jin, Q.et al. Genome sequence of Shigellaflexneri 2a: Insights into pathogenicity through comparison with genomes ofEscherichia coli K12 and O157. Nucleic Acids Research 30, 4432-4441(2002).

5      姜铮,王芳,何湘,黄留玉,袁静.志贺氏菌致病机制研究进展. 中国热带医学9, 1372-1383 ( 2009).

6      朱立, 王恒樑. 志贺氏菌三型分泌系统及其致病机理. 微生物学报 50, 1446-1451 (2010).

7      Kane, K. A. & Dorman, C. J.VirB-mediated positive feedback control of the virulence gene regulatorycascade of Shigella flexneri. Journal of Bacteriology 194, 5264-5273(2012).

8      Gao, X.et al. Structural insights into VirB-DNA complexes reveal mechanism oftranscriptional activation of virulence genes. Nucleic Acids Research 41, 10529-10541 (2013).

9.     Chen BW, Lin MH, Chu CH, HsuCE, & Sun YJ Insights into ParB spreading from the complex structure ofSpo0J and parS. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America112(21):6613-6618 (2015) .

10.   Graham TGW,et al.ParB spreading requires DNA bridging. Genes & Development 28(11):1228-1238 (2014) .