冷冻电镜解析DNMDP-PDE3A-SLFN12复合物结构

本文为读后感，原文见文后，读后感作者：侯彭姣

PDE家族成员广泛地分布在哺乳动物各种组织中，其经典功能是通过磷酸二酯酶活性水解细胞内广泛存在的第二信使cAMP和cGMP成相应的磷酸盐，在信号转导过程中发挥重要功能。PDE超家族共包括11个成员，根据其功能，可分为3大类：第一类是能特异性的水解cAMP; 第二类能特异性水解cGMP; 第三类能同时水解cAMP和cGMP；PDE3A就属于这第三类酶。

关于PDE蛋白小分子抑制剂的开发长时间以来是学术界和工业界的热门研究内容。研究表明，一些小分子抑制剂可以有效的，特异性的杀死肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞的凋亡。其分子机制主要是通过诱导细胞内高表达的PDE3A和SLFN12，并组装成具有一定生物学功能的复合物来发挥作用的。其中DNMDP就是众多小分子中比较突出的一个，它可以有效的抑制肿瘤细胞的凋亡。

相较于PDE家族蛋白，SLFN家族蛋白研究相对较少，关于SLFN12的研究也并不多见。SLFN家族蛋白根据其蛋白分子量大小可以分为3个subgroups: subgroup1中的蛋白大小约37-42KD，主要包含N端domain; subgroup2中的蛋白大小约58-68KD，这些蛋白在包含N domain的基础上，C端又延伸出了一个SWADL domain； subgroup3中的蛋白大小约100-104KD，它们在C端进化出了一个helicase domain. SLFN12属于Group2中的主要成员

该文章通过冷冻电镜技术成功解析PDE3A-SLFN12-DNMDP复合物的结构，进一步阐明了DNMDP可以诱导PDE3A-SLFN12形成异源四聚复合物，从而增强SLFN12的Rnase活性，诱导肿瘤细胞凋亡的具体分子机制。

前期研究表明，DNMDP可以诱导胞内的PDE3A和SLFN12的相互作用。因此作者分别构建表达了SLFN12的全长蛋白和PDE3A的截短体蛋白，该截短体蛋白主要包含其酶活中心部分。其中PDE3A蛋白的理论分子质量是57.3KD，SLFN12的理论分子质量是67.3KD.作者分别通过高盐和低盐两种盐浓度分别纯化两种蛋白及其复合物。发现无论用低盐还是高盐浓纯化两种蛋白，PDE3A和SLFN12的出峰位置均在二聚体的位置出峰，这说明两种蛋白在天然情况下就可以分别形成二聚体；而它们的复合物，在低盐浓度下，无论有没有DNMDP的诱导都可以形成稳定的异源四聚体复合物；而在高盐浓度下只有加入DNMDP才可以形成稳定的异源四聚体复合物。

为了进一步验证PDE3A和SLFN12之间的相互作用，作者分别设计了Pull down 实验和BLI实验进行验证。Pull down 结果显示，在低盐浓度下SLFN12和PDE3A相互作用，DNMDP仅仅使两者之间的相互作用增强了一点点，而另一种小分子抑制剂则抑制了它们之间的相互作用；而在高盐条件下，SLFN12和PDE3A之间的作用特别弱，DNMDP的加入会大大增强两者之间的相互作用，同样，Trequinsin的加入一样抑制两者之间的相互作用。

BLI的实验结果也证明了这一点。以上这些实验表明，天然状态下，SLFN12可与PDE3A存在相互作用，而DNMDP可以有效的增强SLFN12和PDE3A的相互作用，trequinsin则有效的抑制两者之间的相互作用。

DNMDP和trequinsin作为PDE3A的抑制剂，可以与PDE3A结合并有效的抑制PDE3A的酶活性，作者通过晶体学手段发分别获得的PDE3A和cAMP, DNMDP和Trequinsin的复合物的晶体结构，发现，这些小分子抑制剂的结合会阻碍cAMP的结合，从而抑制PDE3A的酶活性，但是并不会引起PDE3A构象发生明显的变化。

那么，DNMDP是怎样诱导PDE3A与SLFN12的结合，Trequinsin 又是通过什么方式抑制两者发生相互作用的呢，作者猜测可能与两个抑制剂暴露在外面的侧链导致的。

为了验证这一猜想，作者构建表达，并成功解析了PDE3A-SLFN12以及小分子DNMDP的复合物，电镜结果显示，该复合物包含一个SLFN12的同源二聚体，和一个PDE3A的同源二聚体，两个DNMDP分别结合在PDE3A的两个酶活性位点。该电镜结构首次解析了hSLFN12全长蛋白结构，对比已经解析的rSLFN13结构可以看到，SLFN12的N domain可以分为3部分，N-lope, C-lope和BD domain，相较于rSLFN13, hSLFN12多出来一段C domain包含PIR domian和core domain ,其中PIR domain主要负责于PDE3A结合。

PIR是处于SLFN12 C端末端的一段序列，通过分析结构发现，PIR可以插入到PDE3A的活性口袋介导两者之间的相互作用，而DNMDP正好可以与PIR domain相互作用，直接增强了PDE3A与SLFN12的相互作用。这也解释了为什么DNMDP可以稳定加强两者之间的相互作用。

将纯化所得SLFN12进行体外酶活实验，实验结果显示，DNMDP可以有效的增强SLFN12的酶活性，而Trequinsin能够消除SLFN12的RNA酶活性；当用不含PIR的截短体SLFN12进行酶活实验，，DNMDP并不会增强其酶活。而细胞实验也表明，当过表达含PIR的SLFN12的相关构建时，细胞对DNMDP的敏感性增加，进而导致细胞凋亡。当表达不含PIR结构域的SLFN12的相关构建的时候，细胞失去对DNMDP的敏感性，使得细胞存活下来。以上实验结果说明, DNMDP可以通过诱导SLFN12二聚化并增强其酶活性，SLFN12活性的增强直接介导肿瘤细胞的凋亡。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-24495-w