LDAF1和Seipin蛋白在脂滴形成时形成

复合物

本文为读后感，原文见文后，读后感作者：张楚

这篇文献鉴定内质网中决定脂滴形成位置的低聚LDAF1-seipin蛋白复合物。这种复合物似乎促进了复合物内甘油三酯中性脂质的相分离，从而确定了脂滴形成的位置。

脂滴(LD):作为膜合成的前体储存脂质，作为代谢能量的储存。LD的形成与肥胖相关代谢综合征、动脉粥样硬化等常见代谢性疾病的发病机制有关。作为细胞器，LDs是不寻常的，因为它的中性脂质核心形成一个油相，由含有特定蛋白质的单层磷脂与水细胞质分离。

在ER中，seipin会根据不同的种类形成含有10-12个亚基的寡聚物。荧光标记的seipin分析表明，它在内质网中形成可移动的病灶，并定位于LDs与内质网相关联的位点，促进LD的生长。值得注意的是，在LD形成的早期时间点，sepin缺乏的细胞会增加小LDs的数量，这些小LDs可能会合并形成非常大的LDs特有的sepin缺乏表型。

1. TMEM159(LDAF1)和seipin在内质网中形成复合物

疏水螺旋结构是seipin高度保守的管腔结构域的一部分，在物种间表现出极强的序列保守性（图1）。我们假设，高序列保守性可能是由于与伴侣蛋白相互作用而导致的进化限制。为了研究这种可能性，我们筛选了可能通过ER双层内的这些螺旋与Seipin相互作用的蛋白质。我们构建了缺失疏水螺旋的Seipin(Seipin-DHH)或其跨膜结构域被另一种ER蛋白FIT2(seipin-TM[FIT2])取代的GFP标记突变体，作为对照(图1）。这些蛋白均在SUM159 seipin基因敲除细胞中稳定表达，并定位于ER膜，与野生型seipin相似。与seipin共沉淀的蛋白质分析鉴定出一种蛋白质，注释为tmem159，在野生型seipin或seipin-TM(Fit2)的纯化中高度富集，但当seipin-dhh从细胞中免疫沉淀时缺失。此外，Western blot分析在野生型seipin或seipinTM(FIT2)的下拉列表中检测到TMEM159，但没有在seipin-DHH中检测到TMEM159，证实了seipin与TMEM159之间存在相互作用，并表明Seipin与TMEM159相互作用需要疏水螺旋.重组生产和纯化的TMEM159-Seipin复合物。负染电子显微镜图像显示这些复合物的11个亚基，类似于报道的人Seipin寡聚结构(yan等人，2018年)，表明Seipin低聚物在TMEM159存在的情况下保持完整。基于我们的发现，我们将TMEM159重命名为脂滴组装蛋白-1(LDAF1)（图2）。

图1：seipin蛋白在不同物种间的疏水helix 具有高度保守性

图2：LDAF1和seipin的co-ip实验和pull-down均具有相互作用。

当我们在SUM159细胞中通过对Seipin和LDAF1内源基因组位点的基因组工程进行荧光标记，我们发现这两种蛋白在内质网中形成了广泛共存的共定位(图3)。细胞含有比LDAF1更多的Seipin,半数的seipin被LDAF1共定位，然而超过80%的LDAF1与seipin重叠.它们的共存不受TG合成抑制的影响(使用酰基辅酶A的抑制剂：二酰基甘油酰基转移酶1[DGAT1]和[DGAT2])，这表明LDAF1-seipin的结合不是由每种蛋白的TG结合介导的。

图3：lDAF1和Seipin蛋白在细胞中共定位

2.LDAF1-seipin复合物决定脂滴的形成位点

为了探索LDAF1参与LD形成的可能性，我们接下来分析了LDAF1在LD形成和成熟过程中与Seipin的关系。为此，我们进一步在含有内源性标记的Seipin和LDAF1的SUM159细胞中通过用HaloTag标记内源PLIN3来引入一种初始LD形成的标记。我们选择PLIN3作为LD形成的标记，是因为将内源性HaloTag标记的PLIN3与其他标记，包括BODIPY493/503、BODIPY标记的脂肪酸或GFP-LiveDrop进行比较，表明HaloTag-PLIN3是LD形成的最早和最敏感的标记。此外，PLIN3可以被设计成一种内源性标记蛋白，最大限度地减少对系统的干扰。对内源性表达HaloTag标记的PLIN3的细胞进行了HALO显微镜观察。我们发现绝大多数LDS形成于同时含有Seipin和LDAF1的斑点.随着时间的推移，LDAF1-Seipin病灶显示，在LD形成的早期，它们与形成LDS的占有率稳步增加(图4，5)。这些发现表明，LDAF1-seipin复合物决定了LDS的形成地点。为了进一步验证这种可能性，并确定我们是否可以观察到LDAF1-seipin复合物中LD的形成，我们在1s的时间间隔上使用时间分辨率更高的HALO显微镜分析了LD的形成。

图4：LD形成在LDAF1和Seipin蛋白的复合物位点

图5：大部分的新生LD形成在复合物的位点

LDAF1-seipin复合物定义LD形成位点的假设预测，将该复合物重新定位到细胞中通常没有它们的区域将导致在这些位点形成LD。招募了LDAF1到ER-质膜(PM)接触位点使用FK506结合蛋白(FKBP)和FKBP12雷帕霉素结合蛋白(FRB)的诱导异二聚，并通过全内反射显微镜(TIRF)监测ER-PM接触位点LD的形成。为此，我们在含有内源性标记的SEIP IN a n d P L I N 3的细胞中共表达了FKBP融合的LDAF1-mScarlet-I(LDAF1mScarlet-I-FKBP)和含有人GAP43蛋白棕榈酰化序列的PM膜诱饵(PM-FRB-TagBFP)(图6）。

图6：LDAF1和Seipin复合物形成脂滴模型

在加入异二聚体(Rapalog)后，LDAF1的群体迅速招募到PM。在大多数情况下，内源性Seipin也被共同招募到PM的LDAF1焦点，这与这些蛋白质形成大分子复合物的模型一致（图7）。LDAF1-seipin复合物在质膜上的募集促进了TIRF显微镜对最初LD形成的跟踪。油酸孵育时，LDAF1-Seipin复合物的位点主要形成LDAF1，但LDAF1或Seipin单独的焦点不形成LDAF1。相反，在没有异二聚体处理的情况下，LDAF1-二聚模块的表达不能在ER-PM接触位点诱导LD的形成，这表明在最初的LD形成中需要LDAF1-seipin复合物(图8).

图7：在加入异二聚体(Rapalog)后，LDAF1的群体迅速招募到PM。在大多数情况下，内源性Seipin也被共同招募到PM的LDAF1焦点

图8：LD形成在LDAF1-seipin复合物处

3.TG在复合物处富集

LDAF1-seipin复合物中或在LDAF1-seipin复合物中形成LDS的假设预测，在LD形成过程中，TGS在这个位置积累。为了检测LDAF1-seipin颗粒是否含有甘油三酯，我们从纯化的复合物中提取脂质并进行薄层色谱分析。纯化的LDAF1-seipin复合物含有TG，分别通过向细胞培养液中添加DGAT抑制剂或油酸来降低或增加TG(图4C)。相反，在没有LDAF1的情况下纯化的Seipin复合物不含有TG，这表明TG的积累只发生在LDAF1-Seipin复合物中（图9）。

图9：TG在复合物处富集

4.  LDAF1在LD形成后从复合物上解离并移动到新生的LD表面

低温电镜分析中高曲率胶束的特征表明，复合物中存在TGS，LDAF1可能从Seipin中解离出来，驻留在新生的LD单层中。因此，我们研究了Seipin和LDAF1在LD成熟过程中的行为。内源性荧光蛋白标记的Seipin和LDAF1的共聚焦显微镜显示，它们在LD形成的初期是共定位的，但在LD成熟过程中LDAF1从Seipin解离并重新定位到LD表面。在LD形成的18h，LDAF1耗尽，并且大多数LDAF1已经重新定位到LD表面(图10）

图10：LDAF1重新定位到脂滴表面

这篇文章发现LDAF1是内质网中seipin的重要激活剂，催化TG的积累和LD的正常形成。与这一假设相一致，我们发现LDAF1缺失时LD形成受损。两种蛋白可能具有不同的生化功能，或者在单独表达seipin的情况下(在LDAF1敲除中)，对LD的形成有间接影响。该蛋白可编码一种膜包埋的双发夹蛋白，其N端和C端均位于胞浆中，并定位于Seioin环状结构中。基于这些发现，我们提出了LDAF1-Seipin复合物上LD形成的模型（图11）。

在这个模型中，LDAF1-seipin复合物决定并催化LD的形成。它怎么可能做到这一点呢？一种可能是通过促进ER双层内的TG相变，例如在复合物的核心提供排除磷脂的空间，从而允许TG分子相互作用，而不是与膜磷脂的侧链相互作用。当新生的LD在复合物内生长时，它将推动Seipin从LDAF1中分离，产生类似于冷冻-EM观察到的弯曲胶束的结构。在LDAF1-seipin复合物的存在下，TG油相的形成可能在较低的膜Tg浓度下发生。这可以防止LD在内质网内随机形成，因为它似乎发生在Seipin(即LDAF-Seipin复合体)缺乏的情况下，支持这一点，我们发现，在没有LDAF1的情况下，LD的形成不是那么有效；对于给定的TG量，LD的形成较少。因此，LDAF1似乎降低了LD形成的能垒，允许它在较低的TG浓度下发生，这是催化的一个标志

另一种可能性是LDAF1-seipin复合物通过膜脂环境的局部变化来定义LD的形成位点。由于Seipin的结构与NPC2脂质结合蛋白有相似之处，并且有报道说它能结合带负电荷的脂质，因此LDAF1-Seipin复合物可能在LD形成过程中调节这些位点的局部脂质合成或运输。在这样的模型中，LDAF1提供给复合物的44个跨膜结构域可以形成一种膜通道，将脂质(如TG或磷脂)转移到新生的LDS。这样的模型并不排除复合物催化TG液滴成核的想法，还需要进一步测试。

总体而言，我们的数据证明LDAF1-seipin复合物是一种进化上保守的核心机制，可以从内质网中产生LDS，并为内质网定位蛋白在启动和管理这一基本过程中的功能提供了一个模型。

图11：LDAF1-Seipin复合物上LDAF1形成的模型

原文：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1534580719308159