Boceprevir，GC-376和钙蛋白酶抑制剂II，XII通过靶向病毒的M pro抑制SARS-CoV-2病毒复制

本文为读后感，原文见文后，读后感作者侯鹏姣

由SARS-CoV-2引起的新冠疫情，于2019年12月左右开始在人类中传播，如今已成为全球大流行病，截至2020年8月2日，全球新冠肺炎的感染人数为18041707，已造成689246人死亡。然而，目前仍没有针对SARS-CoV-2的疫苗或抗病毒药物。在这项研究中，作者报告了针对SARS-CoV-2 M ^pro抑制剂的发现。基于FRET的酶法测定，鉴定出包括boceprevir，GC-376和钙蛋白酶抑制剂II 和XII（calpain inhibitors II, XII）在内的几种抑制剂具有有效的活性，其IC ₅₀值可达亚微摩尔级。并结合酶动力学，热漂移实验和天然质谱实验对几种抑制剂的抑制作用机制进行了探究和验证。值得注意的是，研究中所涉及的boceprevir，calpain inhibitors II, XII不同于已知的M pro抑制剂，它们代表了新型的化学类抑制剂。总体而言，本文鉴定的化合物为SARS-CoV-2治疗剂的进一步开发提供了新的起点。研究内容具体如下：

1.     筛选并鉴定有效的M ^pro抑制剂

作者通过构建并表达出具有生物活性的M 蛋白，其C端含6His tag。基于FRET的酶法测定实验，将该蛋白用于筛选Selleckchem生物活性剂复合库以鉴定出有效的SARS-CoV-2 M pro抑制剂。实验结果显示，四种抑制剂（24、28、29和43）对M pro的抑制作用超过60％。其中simeprevir（24），boceprevir（28）和narlaprevir（29）是HCV NS3-4A丝氨酸蛋白酶抑制剂， MG-132（43）可同时抑制蛋白酶体和钙蛋白酶的活性。

2.     热漂移实验和天然质谱验证抑制剂与SARS-CoV-2 M pro的结合

鉴于初步筛选的结果，作者结合热漂移实验（TSA）和剂量依赖滴定实验进一步验证了4种抑制剂。其中HCV NS3-4A蛋白酶抑制剂（28）和（29）抑制M pro的IC50值分别为4.13和4.73μM，比（24）更有效（IC 50 = 13.74μM ）。TSA实验也表明（28）和（29）与M pro较强的结合能力。但boceprevir（28）和narlaprevir（29）并未抑制EV-A71 2A和3C蛋白酶（IC 50 > 20μM） ，表明它们不是非特异性的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。钙蛋白酶抑制剂MG-132（43）抑制M ^pro的IC 50的值为3.90μM，并且对EV-A71 2A和3C蛋白酶没有活性（IC 50 > 20μM）。TSA法也验证了MG-132与M pro具有较强的结合能力。

在二次筛选中，除了以上4种抑制剂，作者还使用了两种众所周知的病毒3CL蛋白酶抑制剂GC-376（64）和rupintrivir（65）。在我们的研究中，我们发现GC-376（64）是最有效的M pro抑制剂，IC 50值为0.03μM。结合后，M pro的熔解曲线移动了18.30°C。相反，Rupintrivir（65）对M pro（IC 50 > 20μM）没有活性。

天然质谱（MS）进一步表征了四种最有效的抑制剂boceprevir（28），钙蛋白酶抑制剂II（61），XII（62）和GC-376（64）与SARS-CoV-2 M pro的结合。

注：SARS-CoV-2 Mpro - GC-376 (64) (c),

SARS-CoV-2 Mpro - calpain inhibitor II (61) (d),

SARS-CoV-2 Mpro - calpain inhibitor XII (62) (e),

SARS-CoV-2 Mpro - boceprevir (28) (f).

3.     几种抑制剂的抗病毒实验

为了验证几种抑制剂是否是通过抑制M ^pro的活性进而抑制SARS-CoV-2病毒的复制。作者对5种抑制剂进行了细胞的抗病毒实验验证，包括化合物64，28，43，61，和62。首先作者对它们在各个细胞系种的CC₅₀进行了测定。GC-376（64），boceprevir（28）和钙蛋白酶抑制剂II（61）具有良好的耐受性，并且所有测试细胞系的CC ₅₀值均超过100μM。MG-132（43）对所有细胞（除A549细胞外）具有细胞毒性，CC₅₀值均小于1μM。对于所有测试的细胞系，钙蛋白酶抑制剂XII（62）具有可接受的细胞毒性，CC ₅₀值高于50μM。

接下来，我们选择了四种化合物boceprevir（28），钙蛋白酶抑制剂II（61），XII（62）和GC-376（64）用于感染性SARS-CoV-2的抗病毒测定。MG-132（43）由于其细胞毒性而未包括在内。结果显示这四种化合物对SARS-CoV-2具有有效抗病毒活性，EC ₅₀值为0.49至3.37μM。在VYR实验种分析中进一步证实了它们的抗病毒活性。

总而言之，这项研究确定了几种有效的SARS-CoV-2 M ^pro抑制剂，具有有效的酶抑制作用和细胞抗病毒活性。基于这些研究者可进一步开发在临床上有用的抗COVID-19药物。它们可以单独使用，也可以与聚合酶抑制剂（如remdesivir）联合使用，以达到潜在的协同抗病毒效果并抑制耐药性。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32511378/