SARS-CoV-2的S蛋白抗体鸡尾酒可防止单独抗体出现的快速突变逃逸

本文为读后感，原文见文后，读后感作者张楚

对抗COVID19大流行的一个有希望的方法是开发针对SARS-CoV-2 S蛋白的抗病毒抗体。通过与ACE2受体结合，S蛋白是病毒附着和进入靶细胞所需的病毒感染性的关键介质。任何抗病毒治疗的一个重要问题是由于病毒病原体的快速突变而获得抗药性的可能性。当在药物治疗环境中施加选择性压力时，这种耐药性变得更加明显。例如，当艾滋病药物最初单独使用时，这种药物选择的突变导致了广泛的耐药性。随后的HIV联合疗法的成功表明，要求病毒在多个基因位置同时变异可能是避免耐药性的最有效方法。

作者利用基因人源化的小鼠和恢复期人类的B细胞产生大量的针对SARS-CoV-2 S蛋白RBD的高度有效的完全人类中和抗体。生成这个大的集合的预期目标是选择能够同时结合RBD的高效个体抗体对，这可能是治疗性抗体鸡尾酒疗法的理想抗体对，这种鸡尾酒疗法不仅可以作为一种有效的治疗方法，而且可以防止由于病毒逃逸突变而产生的抗体耐药性。

为了评估抗病毒抗体对截至2020年3月底鉴定的公开可获得的SARS-CoV-2序列中所代表的广泛的S蛋白RBD变体的有效性，我们使用了表达SARS-CoV-2的S蛋白突变体VSV伪粒子系统。作者的前八大中和抗体保持了它们对所有测试突变体的效力(表1)。接下来，通过使用复制的VSV-SARS-CoV-2-S病毒，在单个抗体和抗体组合的压力下选择逃逸突变体(图1A)。在第一代中为四种单个抗体中的每一种快速鉴定了多个独立的逃逸突变体(图1，B和C，以及图2)。通过第二代，这些突变体中的一些很容易固定在群体中，代表了100%的测序读数，并且对高达50ug/ml的抗体浓度(比针对亲本病毒的IC50高出约10,000-100,000浓度)具有抵抗力。逃逸突变体的测序(图2)显示，单个氨基酸的变化甚至可以消除与针对所有已知RBD变体的抗体的结合(表1)，并且在低PM IC50(3)下中和亲本病毒。

表1：抗sars - cov-2 S蛋白单克隆抗体在SARS-CoV-2 spike RBD突变体中表现出广泛的中和作用。

对22,872个公开可用的独特基因组序列(截至2020年5月底)的分析表明，存在与研究中确定的两个逃逸氨基酸残基相似的多态性。因此，尽管在自然界中并没有广泛观察到对单个抗病毒抗体有抵抗力的自然变异，但这些罕见的逃逸变异很容易在正在进行的抗体治疗的压力下被选择和扩增。虽然这些研究是在体外用替代病毒进行的，但人们预计，在单一抗体治疗的选择性压力下，SARS-CoV-2病毒在体内也可能发生类似的逃逸突变。虽然VSV和SARS-CoV-2病毒获得突变的不同倾向可能会影响这些逃逸突变的出现速度，但最终逃逸的可能性仍然很高。

接下来，作者评估了之前描述的抗体鸡尾酒(REGN10987+REGN10933)治疗后的逃逸，合理设计以避免通过包含两种抗体来避免逃逸，这两种抗体结合了RBD的不同和不重叠的区域，因此可以同时结合和阻断RBD功能。在这种抗体鸡尾酒存在下培养VSV-SARS-CoV-2-S病毒的尝试没有导致逃逸突变体的生长(表2，图1，B和C，以及图2)。因此，这种选定的鸡尾酒没有快速选择突变体，可能是因为逃逸需要在两个不同的遗传位点同时发生病毒突变，从而消除鸡尾酒中两种抗体的结合和中和。

除了上述鸡尾酒外，我们还评估了用其他组合(REGN10989+REGN10934和REGN10989+REGN10987)治疗后的逃逸，这一次包括完全或部分竞争与RBD结合的抗体-即两种与RBD重叠区域结合的抗体。在这些组合处理的选择压力下，对一种组合有抗性的逃逸突变体迅速产生，但对另一种没有抗性(表2，图1，B和C，以及图2)。对于各组分表现出完全竞争的抗体鸡尾酒(REGN10989+REGN10934)，单个氨基酸取代就足以消除鸡尾酒的中和作用，表明这两种抗体都需要与E484残基结合才能中和SARS-CoV-2。有趣的是，在另一种仅表现出部分竞争的抗体鸡尾酒(REGN10989+REGN10987)中，没有发生这种快速逃逸；当REGN10989预先结合时，REGN10987可以弱结合RBD。因此，即使没有被选择同时结合的抗体组合也可能偶尔抵抗逃逸，因为它们的表位仅部分重叠，或者因为导致逃逸的残基不容易被病毒耐受，因此不容易被选择用于。

为了从功能上证实测序检测到的刺突蛋白突变是导致抗体失去SARS-CoV-2中和作用的原因，作者产生了表达单个已鉴定的刺突突变的VSV-SARS-CoV-2 S蛋白伪粒子。将这些假颗粒用于单一抗体处理和联合抗体处理的中和试验，并计算IC50值(表2和图2)。正如预期的那样，通过在四种单一抗体以及REGN10989+REGN10934竞争抗体鸡尾酒存在的情况下传代病毒而选择的具有氨基酸突变的伪颗粒，足以在这些检测中完全消除或极大地降低这些处理的中和能力。在由两种抗体(例如，由REGN10934和REGN10987两者产生的K444Q)产生的病毒群体中，在早期传代中低频率检测到但在后期仅由其中一种抗体(REGN10987)固定的单一逃逸突变体，能够消除两种处理的中和作用。这表明抗体可以推动病毒向不同方向进化和逃逸。然而，如果两个抗体有部分重叠的结合表位，那么一个固定在病毒群体中的逃逸突变体可能会导致另一个抗体活性的丧失-这突显了广泛使用单一抗体治疗的风险。重要的是，REN10987+REGN10933抗体鸡尾酒-由两种抗体组成，可以同时与RBD上的两个独立表位结合-保持了其中和所有已识别的突变体的能力，即使是那些通过用其一种成分单一处理而选择的突变体也是如此。

在对传代病毒库的测序中，发现了RBD结构域以外的多个突变，其中大多数在对照样本中以不同的丰度存在，包括最初的接种量和仅限病毒的传代(图2)。其中最丰富的突变(H655Y和R682Q)位于S蛋白的S1‘/S2’裂解位点附近，并在多碱基呋喃类裂解位点内含有残基。该区域的突变和缺失已经在组织培养传代的VSVSARS-CoV-2-S和SARS-CoV-2病毒中被鉴定，并可能代表组织培养适应

众所周知，RNA病毒会随着时间的推移积累突变，任何抗病毒治疗的一个重要问题是选择治疗诱导的逃逸突变体的可能性。一种防止逃逸到抗体疗法的常用策略包括选择与保守表位结合的抗体，然而这一策略可能还不够。虽然基于序列和结构分析可以对表位的保守性进行一些知情的分析，但在强大的选择压力下仍然存在逃逸的可能性。在多种冠状病毒中表现出广泛中和的抗体，因此可能针对更保守的残基的抗体，尚未被证明对选择性压力下的逃逸具有免疫力。此外，它们的中和效力比针对SARS-CoV-2的最有效的中和抗体低几个数量级。中和被认为是抗冠状病毒S蛋白抗体的关键作用机制，以前在动物模型中已被证明与疗效相关，因此可能被证明是最初临床疗效的最重要驱动因素。然而，正如我们的单抗逃逸研究所证明的那样，即使是高度有效的中和也不能防止病毒逃逸突变体的快速产生，而逃逸仍然是单个抗体方法的主要关注点。

这里描述的数据强烈支持这样的观点，即鸡尾酒疗法可能提供一种有效的方式来最大限度地减少SARS-CoV-2的突变逃逸；特别是，我们的研究指出了抗体鸡尾酒的潜在价值，在这种情况下，选择两种抗体以结合病毒靶标的不同和不重叠的区域(在这种情况下，是刺突蛋白的RBD)，因此需要不太可能在两个不同的遗传位点同时发生突变才能使病毒逃逸。一个广泛效力的临床候选选择标准，包括针对自然循环序列变体的功能评估，以及包括具有非重叠表位的多个抗体，可能会提供增强的保护，防止有效性丧失。未来的活体动物和人类临床研究需要密切关注可能出现的逃逸突变和随后可能的药物疗效丧失。

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