抗肿瘤药物Carmofur抑制SARS-CoV-2 MPro蛋白酶结构生物学基础

本文为读后感，原文见文后，读后感作者侯彭姣

2019年12月以来，由SARS-CoV-2引起的高传染性病毒性疾病COVID-19在全球范围内迅速传播，造成了前所未有的世界范围内的大流行。截止目前，世界范围内确诊病例的数量仍以快速的速度增长。然而，目前尚无特定的药物或疫苗用于控制新冠肺炎的临床症状或传播。因此，研究并开发有效的针对性药物和疫苗迫在眉睫。SARS-CoV-2的MPro在其转录复制中发挥重要作用，并因MPro在冠状病毒属中具有高保守性，使其成为研究SARS-CoV-2有效药物的重要靶标。

Carmofur（1-hexylcarbamoyl-5-fluorouracil），属于5-氟尿嘧啶（5-FU）的衍生物，是一种有效的抗肿瘤药物，已被批准用于结直肠癌，胃癌，乳腺癌和膀胱癌的临床治疗。Carmofur发挥作用的主要靶标是胸苷酸合成酶，但后续研究发现Carmofur也可通过与人的酸性神经酰胺酶（AC）上的半胱氨酸共价结合抑制AC的活性。

本研究通过筛选10000多种化合物，发现并确定了抗肿瘤药物Carmofur可在体外抑制MPro的活性，IC50为1.82uM。通过对Carmofur与MPro形成的复合物晶体结构进行解析发现，其与之前的研究报道一致，MPro可形成2个同源二聚体，分别为protomer A和B，每个protomer含3个结构域，结构域Ⅰ（10-99aa），结构域Ⅱ（100-184aa），结构域Ⅲ（201-303aa）。其中MPro的底物结合口袋位于结构域I和II之间的缝隙中，并含有具有催化活性的催化二联体，Cys145和His41。底物结合口袋又可分为4部分，分别为S1，S2，S4和S1'，如下图所示。

结构表明Carmofur的反应性基团（C7H14NO）中的羰基可与MPro中Cys145上的Sγ原子形成1.8Å的共价键，Carmofur的脂肪酸尾部则插入到S2中。除了形成C-S共价键外，该抑制剂通过与该蛋白之间的氢键和疏水作用来稳定两者之间的相互作用的稳定性。如Carmofur中的羰基氧占据了氧阴离子孔，并与Gly143和Cys145的骨架酰胺形成氢键（3.0Å），模仿了蛋白酶切割过程中形成的四面体氧阴离子中间体（如上图e）；Carmofur的脂肪酸尾部则插入到庞大的疏水性的S2中，主要与His41，Met49和Met165的侧链形成疏水作用。

此外，通过对比N抑制剂与MPro复合物的结构显示，两者之间的差异表现在两方面：1. 与Mpro-N3相比，最大的构象差异体现在，在Mpro –Carmofur中，围绕Carmofur的蛋白骨架略微向外；2. Mpro-Carmofur中Carmofur仅占据了底物结合口袋中的一个位点S2，而M pro-N3中N3占据了4个位点，S1，S2，S4和S1'。这说明Carmofur可作为药物靶点的优化空间很大，可进一步细化设计一系列衍生物用于抑制SARS-CoV-2的MPro的活性。

此外，作者还开展了针对Carmofur抑制SARS-CoV-2的细胞学实验。

首先，作者通过测定细胞上清液中的病毒RNA，确定了Carmofur的EC 50值为24.30μM。为了进一步验证这一结果，作者又进行了免疫荧光实验进行验证，研究结果显示，经Carmofur处理的细胞，其胞内的病毒核衣壳蛋白（NP）表达量明显降低，说明Carmofur在细胞水平可有效的抑制病毒的复制。

其次，作者还设计了细胞毒性实验，观察Carmofur对Vero细胞的毒性作用，测得其CC50为133.4uM。

以上的研究通过解析M pro与Carmofur复合物的晶体结构表明Carmofur可直接与SARS-CoV-2 M pro中的Cys145 共价结合从而抑制Mpro的活性，并通过细胞学实验进行了验证。该研究为合理设计对Mpro具有增强抑制效果的Carmofur类似物提供了坚实的结构学基础。由于Mpro在所有冠状病毒中高度保守，因此Carmofur及其类似物可作为研究广谱的抗病毒药物的理想切入点。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41594-020-0440-6