磷酸二酯酶AtaC水解c-di-AMP促进多细胞细菌的分化

本文为读后感，原文见文后，读后感作者朱凯祥

c-di-AMP作为细菌的第二信使，除了在宿主-致病菌相互作用以及细菌毒力方面发挥作用，如被宿主的先天免疫受体STING、DDX41、ERAdP、RECON等识别调控I型干扰素免疫反应和NF-kB信号通路；还参与细菌与环境相互作用的过程，如参与离子通道和渗透压的调节。合成和降解核苷酸的酶和结合第二信使的蛋白质，是信号转导途径的关键组成部分。作为最大的细菌门之一，大多数放线菌是如何阻止c-di-AMP信号的，以及哪些蛋白质与分子结合以引发细胞反应，这一直是未知的。这篇文章中，作者在链霉菌属中鉴定出了一个磷酸二酯酶AtaC通过水解作用参与终止c-di-AMP信号，以及一个能与c-di-AMP形成复合物的蛋白CpeA参与渗透压的调控。作者还证明了c-di-AMP的平衡对于多细胞细菌从菌丝到孢子的发育过渡至关重要。

具体结果如下：

　图1　　　　　　　　　　　　　　　　　　图２

    c-di-AMP是由腺苷酸环化酶（DAC）催化2个ATP分子形成的。首先，作者通过序列保守性分析在S. venezuelae菌中发现c-di-AMP是由DisA这个蛋白参与合成。为了验证DisA蛋白的DAC活性，作者纯化了His标签的DisA蛋白以及点突变蛋白DisAD86A，用B. subtilis的DisABsu作为阳性对照，通过同位素标记的32P-ATP作为底物，进行了薄层层析实验（TLC），确定了DisA的DAC活性（图1A）。而体内不同生长时期检测c-di-AMP时发现vegetative 生长期，ΔdisA中依然能检测到低表达的c-di-AMP（图1B），原位互补后用抗体能检测到DisA（图1C），说明disA是组成型表达。

随后，作者通过生物信息学手段在S. venezuelae中找到了两个蛋白（Vnz_27310 和Vnz_31010）分别属于磷酸二酯酶和金属磷酸酶超家族。体外磷酸二酯酶活性实验确定了Vnz_27310（AtaC）可以特异性水解c-di-AMP到中间产物5′-pApA，最后生成AMP (图2A)。结构模拟比对发现AtaC与PDB库中的PhnA（3SZY）的核心区域相似，从而确定了蛋白的活性位点（图3A）。小角散射SEC-SAXS 的数据也与HHpred的模型相吻合（图3B）。nanoDSF实验确定了AtaC的稳定依赖Mn2+（图3C），加入EDTA或突变体AtaCD269N不能结合Mn2+和水解c-di-AMP（图３D、Ｅ），但是却依然可以结合c-di-AMP（图３F）。ITC实验也对突变体蛋白AtaCD269N结合c-di-AMP的能力作了验证（图３G、H）。以上从结构和生化功能方面对AtaC进行了阐释。

图３

    接下来，为了研究S. venezuelae的disA和ataC以及c-di-AMP的生理功能，作者首先分析了突变株的发育表型。ΔdisA 的菌落形态会变绿（图４A），并且扫描电镜确认 disA突变体的的孢子形态与野

                              图４

生型是相似的（图４B），说明DisA和c-di-AMP对细菌的分化不是必需的。相反，ΔataC突变体会影响菌落的形态以及孢子的形成，当互补ataC时表型会得到恢复。然而在高盐培养条件下，ataC突变体的存活能力要比disA突变体强（图４D），说明c-di-AMP可能会影响链霉菌渗透压平衡。以上实验表明AtaC水解c-di-AMP对链霉菌的正常发育至关重要。

那么，c-di-AMP的靶点又是什么呢？作者这里通过生物信息学分析发现RCK＿Ｃ结构域拥有(I/L)(I/L)X2DX1RX5N(I/L)(I/L)特征去结合配体c-di-AMP，这里他们发现了RCK_C结构域蛋白CpeA(Vnz_28055)拥有假定的c-di-AMP结合motif（图５A）。他们纯化了CpeA蛋白，通过差异性配体毛细辐射实验 (Differential radial　capillary action of ligand assay，DRaCALA)，确定了CpeA能够结合[32P]-标记的 c-di-AMP，在竞争实验中，过量的c-di-GMP、 cAMP、 5′-pApA， 或 ATP都不会影响[32P]-c-di-AMP-CpeA复合物的形成，说明CpeA特异性结合c-di-AMP（图５B）。生物信息学分析显示cpeA与cpeB(vnz_28050)形成保守操纵子（图５D），通过细菌双杂交实验，作者确定了cpeA与cpeB能形成复合物，DisA的存在会加强CpeA-CpeB的相互作用，说明DisA产生的c-di-AMP促进CpeA-CpeB的相互作用（图５Ｅ）。因此，作者提出c-di－AMP通过刺激CpeA调控单元复合物的形成来控制CpeB的离子转运活性的模型。

总结：在这篇文章中，作者确定AtaC是细菌中c-di-AMP代谢的组成部分，并发现CpeA是链霉菌中c-di-AMP与离子平衡之间的潜在联系。在自然界中，这些细菌主要生活在土壤的上层，在那里它们经常面临干旱和降雨带来的渗透压变化条件。这里描述的c-di-AMP通路可能对适应这样一个具有挑战性的生态系统至关重要。

原文：c-di-AMP hydrolysis by the phosphodiesterase AtaC　promotes differentiation of multicellular bacteria

原文链接：https://www.pnas.org/content/117/13/7392