JNK-IN-8 结构式

JNK-IN-8是第一个不可逆的JNK抑制剂，作用于JNK1，JNK2和JNK4，在A375细胞系中IC50分别为4.7 nM，18.7 nM和1 nM，比作用于MNK2，Fms选择性高10倍以上，对c-Kit， Met， PDGFRβ没有抑制作用。

体外研究：JNK-IN-8抑制HeLa和A375细胞中c-Jun的磷酸化，EC50分别为486 nM和338 nM。JNK-IN-8与IRAK1，PIK3C3，PIP4K2C和PIP5K3结合显著提高选择性和消除率。JNK-IN-8对JNK2的抑制，需要Cys116的参与。[1]JNK-IN-8 (10 mM)抑制IL-1R 细胞中IL-1β刺激的c-Jun磷酸化作用，是已确定的JNKs机制。JNK-IN-8与JNK亚型共价结合，引起JNK亚型的电泳迁移略微延迟。[2] JNK-IN-8被发现能够通过丙烯酰胺激酶抑制剂表达库中广泛的激酶选择性能抑制JNK激酶，使用KinomeScan方法基于imatinib的结构发挥作用。相对于imatinib，JNK-IN-8具有明显的1,4-双苯胺和1,3-氨基苯甲酸结构区域选择性，并且使用N,N-二甲基丁烯乙酰胺结合共价靶点Cys154。JNK-IN-8采用L形的I型结合构象，接入位于ATP结合位点边缘的Cys 154。[3]

JNK-IN-8和JNK-IN-7在结构上非常相似，但是前者是JNKs的特定共价抑制剂。

结合动力学试验：结合动力学测定，A375细胞用1 μM JNK-IN-8按照指示的时间预处理。移除培养基，用PBS清洗3次。将细胞沉淀重悬浮于1毫升裂解缓冲液(1% NP-40，1% CHAPS，25 mM Tris，150 mM NaCl，磷酸酶抑制剂Cocktail，和蛋白酶抑制剂Cocktail)。4℃下首尾相连旋转30分钟。裂解物在Eppendorf中以1.4×104 rpm离心15分钟分离。使用10DG柱，将澄清裂解液通过凝胶过滤到激酶缓冲液中(0.1% NP-40，20 mM HEPES，150 mM NaCl，磷酸酶抑制剂Cocktail，蛋白酶抑制剂Cocktail)。凝胶过滤的裂解物中总蛋白质浓度应该在5–15毫克/毫升。细胞裂解物用5 μM ActivX探针标记1小时。样品用DTT还原，半胱氨酸被碘乙酰胺阻滞，凝胶过滤以除去过量的试剂，并更换缓冲液。加入1体积的2×结合缓冲液(2% Triton-100，1% NP-40，2 mM EDTA，2× PBS)和50微升链霉珠浆液，首尾相连旋转2小时，以7,000 rpm离心2分钟。用1×结合缓冲液清洗3次，用PBS清洗3次。将30微升1×样品缓冲液加入小球；样品在95℃下加热10分钟。将样品在SDS-PAGE凝胶上于110V下运行。转移之后，将膜用JNK抗体免疫印记。

[1] Zhang T, et al. Chem Biol, 2012, 19(1), 140-154.

[2] Goh ET, et al. Biochem J, 2012, 441(1), 339-346.