转录调控因子是一类通过调控下游靶基因的表达进而控制细胞代谢过程的一类蛋白质，在植物生长发育和耐逆抗病过程中发挥极其重要的调节和控制作用（余迪求等，2005）。根据转录调控蛋白的结构特点可以将其分为若干个家族，其中WRKY转录调控因子家族是一个多成员的大家族，拟南芥拥有72个成员，粳稻日本晴拥有98个成员，中国籼稻93-11拥有102个成员（Qiu等，2004；Ross等，2007）。WRKY转录调控因子以其典型的保守结构域WRKYGQK高亲和性地结合DNA的W盒（C/TTGACT/C）而自成一个家族（Eulgem等，2000）。同时WRKY转录调控因子氨基酸序列上毗邻WRKY域的还有一个C₂-H₂的锌指结构，这一结构特点类似乙烯应答因子（ERF）家族（Gutterson 等，2004）。与大多数WRKY蛋白不同，拟南芥WRKY家族中的AtWRKY50，AtWRKY51和AtWRKY59的WRKY结构域序列为WRKYGKK，而水稻WRKY家族的一些成员中则出现新的WRKY结构域序列WRKYGEK（Qiu等，2004）。

得益于水稻全基因组测序工作，水稻WRKY基因家族成员的功能研究近年来取得了很大的进展。已经发现水稻WRKY蛋白参与了稻瘟病病理信号途径、水杨酸相关的抗病信号途径、以及包括紫外辐射耐受在内的逆境响应信号途径等。自2000年克隆到第一个水稻WRKY基因OsWRKY4后（Kim 等，2000），已经发现近20个水稻WRKY基因受真菌性的稻瘟病诱导，超过10个水稻WRKY基因受细菌性的白叶枯病诱导( Ryu 等，2006)。近年来又在水杨酸依赖的抗病信号途径中发现OsWRKY12和OsWRKY71处于OsNH1的上游（Liu 等，2005；Liu等2007），而OsWRKY45独立于OsNH1信号通路（Shimono 等，2007）。此外，由我们实验室承担的水稻胁迫条件下相关WRKY转录调控因子基因的筛选工作预示一些水稻WRKY基因家族成员可能参与了水稻对环境胁迫因子的响应（Qiu 等，2004）。而新近发表的过表达OsWRKY100基因增强水稻对紫外辐射耐性的结果（Wang 等，2007）和正在发表的转基因OsWRKY45增强拟南芥耐旱性的结果（Qiu 等，2008）都从遗传学的角度证实了先前我们利用分子生物学手段对水稻WRKY转录因子参与植物耐逆性的预测。

WRKY转录调控因子除了在植物抗病耐逆过程中发挥重要的生物学作用外，还参与了植物发育过程的调控。如AtWRKY44（TTG2）不单可以控制拟南芥表皮毛和种皮的发育（Johnson 等，2002），还可以影响拟南芥表皮的分化和根毛的形成（Ishida等，2007）；而AtWRKY10（MINI3）则可以和其他基因一起控制拟南芥种子的发育（Luo 等，2005）；由美国内华达大学Qingxi J. Shen教授领导的小组发现在α 淀粉酶基因表达的过程中，OsWRKY51和OsWRKY71的表达受ABA抑制、GA诱导（Xie 等，2005；Xie等，2006），而它们的表达情况则会决定种子的发育和萌发（Ross等，2007）。最新的结果显示一些WRKY基因在水稻中的表达是有组织特异性的，预示它们在水稻发育过程中生物学功能的多样性（Ramamoorthy等，2008），而中国农业大学的郭泽建教授领导的小组也确实发现了OsWRKY55的过表达影响了水稻不定根的发育和转基因水稻的生长素反应（Zhang等，2008）。

基于以上WRKY转录调控因子的重要作用，我们利用分子生物学和反向遗传学的方法对OsWRKY72（DAA50784）（Xie等，2005；Kato等，2007）基因的异源高表达拟南芥进行了分析。已有的研究发现OsWRKY72、CjWRKY01和AtWRKY75三者间存在较高的同源性（Kato等，2007），而在水稻糊粉层细胞内的OsWRKY72受ABA诱导但不受GA₃诱导（Xie等，2005）。我们的结果显示OsWRKY72基因在水稻幼叶中的表达量较高。OsWRKY72连接35S强启动子异源转化拟南芥发现随着其表达量的增强，转基因植株出现明显的顶端优势减弱而产生了较多的分支，此形态特征与空载体转基因植株相比差异明显。另外，转基因拟南芥还出现成苗叶形变小且卷曲，角果缩短并伴随部分败育等生理现象。进一步的分析发现OsWRKY72的高表达抑制了拟南芥生长素相关基因AXR1的表达。这些都预示OsWRKY72在植物形态建成过程中影响了其生长素信号通路。

2 结果与分析

      2.1 OsWRKY72基因的组织表达

利用Northern杂交技术，我们对OsWRKY72基因在水稻各部位的表达情况进行了分析。用OsWRKY72 全长cDNA作探针杂交后放射自显影，结果显示OsWRKY72在叶片和花序中均有表达，在幼叶中的表达量明显高于成熟叶、旗叶和老叶（图1）。Ramamoorthy等新近的表达谱分析在证实上述结果可靠性的同时补充了该基因在幼苗根部表达较强而在成苗根部几乎不表达的结果。这些都说明OsWRKY72具有部位表达的特异性，在生长旺盛的部位表达较强。

2.2 转基因拟南芥筛选

为了深入探讨OsWRKY72基因的生物学功能，我们将OsWRKY72 基因转化拟南芥。通过筛选，T1代得到19株转基因植物，其中4株未能得到种子。T2代中#19表型与其他14株转基因植物明显不同，经检测不表达OsWRKY72。在剩余14株转基因植株中，我们分别选取了一株中等表达水平和一株高表达水平的转基因植株用于观察实验和数据采集，并以转空载体的转基因植株为对照，其它转基因植株主要用于定性观察。如图2所示，株系15号为中等表达水平的转基因植株，株系17号为高表达水平的转基因植株。

2.3 高表达OsWRKY72基因的转基因植物叶片向下卷曲

在转基因拟南芥的生长过程中，我们发现高表达OsWRKY72基因的转基因植物莲座叶和茎生叶明显比转空载体的转基因植株小且幼嫩，部分叶片叶尖明显下卷。通过激光共聚焦扫描显示：与转空载体的转基因植株相比，高表达OsWRKY72基因的转基因植株叶片表皮细胞未发生变化，而栅栏层细胞变大且细胞间隙较疏松（图3：A，B）。这可能是高表达OsWRKY72基因的转基因植物叶片卷曲和变嫩的生理原因之一。

2.4 高表达OsWRKY72转基因植物的角果变短或者败育

在转基因拟南芥果实的发育过程中，我们发现与转空载体的转基因植株相比，高表达OsWRKY72基因的转基因植物角果长度明显较短，且随着OsWRKY72表达量的增加，高表达植株出现角果逐步缩短，且败育果荚的数目增多（图4：A，B）。此结果说明高表达OsWRKY72影响了转基因拟南芥角果的发育和种子的形成。

2.5 高表达OsWRKY72基因降低转基因植物的顶端优势

纵观高表达OsWRKY72转基因植物整体形态，与转空载体的植株相比，侧枝的发育较转空载体的转基因植株强盛，主枝与侧枝的明显差异消失（图5A）。经统计发现随OsWRKY72的表达量增加，高表达OsWRKY72转基因植物侧枝的分支数明显的较转空载体的转基因植物增多（图5B）。众所周知，植物顶芽会不同程度的抑制腋芽的生长，而这一特性在高表达OsWRKY72转基因植物上明显发生改变，即其顶端优势现象明显受到抑制。另外这一现象在转基因烟草中也得到了重复，图5C显示转基因烟草的侧芽发育明显较对照强。

3. 讨论

植物顶端优势的改变在一定程度上反映了其生长素信号通路的变化（McSteen 等，2005），而现已普遍认为生长素可以促进一些器官细胞的伸长（Jones，1994）和调控叶片的发育（李林川，瞿礼嘉，2006），更加明确的是生长素信号通路受阻会强烈影响种子的形成和果实的发育（Wang等，2005；Goetz等，2006），因而上述叶片向下卷曲、角果发育不良、顶端优势降低的现象暗示高表达OsWRKY72可能影响了转基因植物的生长素信号通路。

另外OsWRKY72基因在生长旺盛的幼嫩组织强烈表达（图1）的事实促使我们想进一步探讨影响植物生长发育的激素是否能有效地调控其表达水平？而事实上根据Xie等2005和Ramamoorthy等2008的表达谱分析发现OsWRKY72确实受ABA和IAA的诱导，因此我们推测OsWRKY72可能参与了脱落酸和生长素的信号途径。进一步调查生长素信号通路相关基因的突变体后我们发现，35S：：OsWRKY72植株的表型确实很大程度的与bud1（Dai 等，2006）、axr1（Lincoln 等，1990）、aux1 （Cernac 等，1997）、atmdr1-1 atpgp1（Noh 等，2001）等突变体表型高度相近。为此我们检测了AXR1基因在35S：：OsWRKY72植株抽苔后的表达情况，结果发现它在35S：：OsWRKY72植株的表达量比在野生型的表达量低（图6A）。由此我们推断是否是以AXR1基因为代表的生长素相关基因因OsWRKY72基因的高表达而受抑制进而导致相关表型的出现。

植株侧芽发育增强及叶卷曲等现象与AXR1和BUD1基因的变化相关联（Stirnberg等，1999; Dai 等，2006）。而BUD1基因编码MAPKK7激酶，可以在上游负调控AXR1、AUX1、MDR1和PGP1等基因的表达（Dai 等，2006）。MAPKK激酶家族共有10个成员，与60个MEKK激酶和21个MAP激酶共同组成三级磷酸化级联网络（MAPK group，2002）。现已在拟南芥中发现MAPK成员和WRKY成员间可以相互作用，如MEKK1在蛋白水平和转录水平上都可以直接和WRKY53发生相互作用进而影响衰老和抗病信号通路（Miao 等，2007），MAPK4可以在转录水平上调控WRKY25和WRKY33进而影响抗逆信号通路（Andreasson 等，2005），MEKK1、MKK4/MKK5、MPK3/MPK6组成的级联体系很可能在上游调控WRKY22和WRKY29（Asai 等，2002），对突变体进行诱导发现WRKY33和WRKY53与处于其上游的MPK6/MPK3之间具有强烈的关联性（Wan 等，2004）。另外bud1是一个BUD1基因过表达的突变体（Dai 等，2006），它和高表达OsWRKY72的转基因植株以及axr1敲除突变体表型和生理变化十分相近，暗示WRKY转录因子和MAPKK7直接或者间接的调控或者影响下游生长素极性运输相关基因进而产生与它们突变体相近的表型。

综合以上证据和推论我们认为OsWRKY72基因确实影响了生长素极性运输信号通路，它的高表达很可能通过与MEKK7互作直接或者间接的调控生长素极性运输相关基因，从而造成生长素的信号通路自身节点蛋白的变化进而影响生长素指导的生长发育，特别是影响植物顶端优势。而对这一现象形成的分子机制做进一步的研究探索将有利于我们对植物顶端优势等的生长素反应的认识和利用。