基于液态基底的细胞培养新方法构建功能化血脑屏障

137 Functional Blood Brain Barrier Model with Tight Connected Minitissue by Liquid.pdf

为了充分了解人体组织或器官的结构和功能，在体外高保真地重建仿生组织至关重要。仿生组织应该与人类组织一样具有高细胞密度以及紧密连接结构，而不是作为单个单分散细胞存在。然而，传统的培养皿式固态基底细胞培养方法培养后需要消化细胞，难以再现体内细胞微环境，这导致细胞表型和基因型的差异，影响生命科学和临床医学研究的可信度。为了解决上述问题，不同于培养皿式的固态基底培养，我们提出了液态基底的细胞培养新方法LSC（Liquid Substrates Culture），“高密度、具有化学惰性且不与培养基互溶的支撑液体作为细胞培养基底进行细胞培养”。液态基底培养能够诱导细胞自发组装成高细胞密度、紧密连接的迷你组织。由于是液态基底，不需要任何消化酶，就可将培养出的迷你组织与基底分离，能够保持迷你组织的完整细胞微环境。

进一步，我们利用液态基底培养方法构建了仿生血脑屏障（BBB）模型，得益于接近体内血脑屏障的高密度结构，体外BBB模型的跨膜电阻比文献报道的BBB模型高1-2个数量级，接近体内水平，具有很好的药物选择性通透能力，能为脑部用药提供更有效的评价。

相关研究“Functional Blood-Brain Barrier Model with Tight Connected Mini-tissue by Liquid Substrates Culture”近期发表在Advanced Healthcare Materials杂志上，浙江大学机械学院刘念博士为第一作者，贺永教授为通讯作者。 

图1 血脑屏障（BBB）模型和液态基底培养（LSC）方法

我们开发了一种液态基底培养（LSC）方法，该方法允许锚定依赖性贴壁细胞自发组装成高细胞空间密度、紧密连接的迷你组织。在这种新颖且易于使用的方法中，氟化油作为支撑液散布到培养板上。在添加培养基和细胞悬浮液之后，细胞自然沉降在由氟化油和培养基形成的界面处。由于氟化油的表面没有细胞的结合位点，因此细胞倾向于自发地充当彼此的结合位点，致使细胞间分泌的丰富的细胞外基质从而自组装形成迷你组织。成熟的迷你组织可以在无需使用胰蛋白酶消化的情况下从液态基底中完整地取出，并且可以进一步用于构建体外人血脑屏障（BBB）模型。

图2 LSC方法构建仿生BBB模型

我们使用LSC方法制造的迷你组织构建体外BBB模型。首先，分别通过高分辨率3D打印和电流体动力学（EHD）打印制作了与孔板匹配的定制支架。将支架消毒后放置在孔板中即可按照上述LSC方法制作迷你组织。当细胞自组装形成迷你组织后，缓慢提起支架用于承接迷你组织并从氟化油-培养基界面上移出。然随后将带有迷你组织的支架转移至定制的BBB支架上并用GelMA水凝胶作为粘合剂进行固定和封装形成仿生BBB模型。整个BBB模型浸润于培养基中，紧密连接的迷你组织将其分割为上下两个腔室。上腔室相当于血管，并且半开放结构便于药物测试。下腔室相当于脑组织，通过测量下腔室内的药物浓度可以反映药物渗透的程度。

图3 LSC方法构建迷你组织的活力与功能

LSC方法对于不同类型的细胞具有普适性。使用LSC方法培养的细胞活力与常规方法培养时的细胞活力相当。有趣的是，这种新的培养方法能促进细胞向迷你组织发育，提高了迷你组织对药物的敏感性，并增强了功能性生化因子的表达。

图4 LSC方法构建迷你组织的自愈和能力

LSC培养过程中获得的迷你组织表现出与正常组织相似的自修复能力。自愈合迷你组织可能会被进一步设计和开发用于未来更先进的生物医学应用。

图5 LSC方法构建迷你组织的微观结构与紧密连接

业界共识，通常用于细胞培养的固体基底并不代表生物体中的天然细胞环境。在这种简化的条件下，细胞表型、机械和生物化学线索会发生变化，甚至消失。在固体基底培养的细胞由于过高的基质模量（远远超过其原生环境的模量）以及缺乏三维微环境支持而与基底平贴。尽管许多细胞堆积成多层，但仍观察到细胞之间的显著间隔，导致细胞间通讯效率低下。有趣的是，通过LSC方法培养的每个细胞的表型都是立体球体，与在体内观察到的相似。由于其形状的规则性和对称性，立体球形细胞自发地自组装形成六方最密堆积结构，具有更紧密的细胞间间隔，有助于更有效的细胞间通信。此外，LSC培养条件下ZO-1、OCLN、CLDN5具有高表达，表明在迷你组织中形成了紧密连接结构。

图6 LSC方法构建迷你组织的生物学机制

除了细胞表型的改变外，LSC方法在迷你组织中的基因表达也存在显著差异。此外，我们研究LSC方法制造迷你组织的生物学机制。实验结果表明，组装的肌动蛋白丝产生的细胞间相互作用对迷你组织的形成至关重要。接种在氟化油-培养基界面的细胞在Rho依赖性激酶的调节下形成细胞间相互牵引力，从而自发自组装形成迷你组织。

图7 仿生BBB模型的屏障功能

由于紧密连接的结构，通过LSC方法构建的仿生BBB模型具有与正常生理水平相当的高跨膜电阻。值得注意的是，在该BBB模型中获得的跨膜电阻值比通常报道的BBB模型高1至2个数量级。此外，VE钙粘蛋白(VE-cadherin)和黏着斑蛋白(vinculin)在迷你组织中高度表达。具有不同分子量的FITC葡聚糖在渗透性方面表现出一致的差异，即构建的仿生BBB模型对FITC葡聚糖渗出具有更强的屏障效应，FITC葡聚糖的渗透性随着分子量的增加而降低。

图8 仿生BBB模型的药物反馈、特异性转运蛋白和外排泵活性

使用甲基苯丙胺处理构建的仿生BBB模型后，更多的FITC葡聚糖渗出，表明血脑屏障的通透性增加。当终止甲基苯丙胺并在正常条件下培养24小时后，FITC葡聚糖的渗出量显著减少，表明BBB的通透性被成功逆转，显示了BBB模型具有自我修复能力，可以重建药物损伤的紧密连接。

多巴胺在体内不能穿透BBB，而左旋多巴胺可以通过LAT-1转运蛋白主动转运穿过BBB。在构建的仿生BBB模型中，左旋多巴胺的渗出剂量和相对渗出率显著高于多巴胺，显示了BBB模型具有选择性透过能力。

此外，构建的仿生BBB模型中具有高水平的P-糖蛋白（MDR1/ABCB1，P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP/ABCG2）外排泵表达，显示了BBB模型具有主动转运的外排泵活性。

文章来源：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adhm.202201984