大尺寸血管化组织的同轴生物3D打印方法

4 Directly Coaxial 3D Bioprinting of Large-scale Vascularized.pdf

【背景】组织/器官内的血供系统，为组织提供了必须的营养及代谢交换。而组织体外重建时当尺寸>200μm时，就会超出营养/氧气的扩散极限，需要构造丰富的血管系统，避免内部营养输送不畅。

2015年，我们提出组织+营养通道一次性制造的同轴生物打印方法（Biomaterials, 2015，61, 203-215）[A1] ，用来制造带有营养流道的大尺寸结构，如图1所示。其基本原理是：将交联剂/水凝胶材料分别通入同轴喷头的内/外通道，交联剂和水凝胶在喷嘴出口处相遇，水凝胶发生快速交联形成中空凝胶管，再将凝胶管通过层层沉积形成带有流道的三维结构。然而，当时采用灌流内皮细胞悬液进行了血管化尝试，效果不佳，因为灌流内皮细胞悬液的方式只能实现简单结构的血管化，故而15年的工作重点聚焦在提升大尺寸组织的营养输送效率。

图1 同轴打印血管通道

16年我们开始探索如何深化，19年我们通过耦合牺牲打印和同轴打印工艺，提出组织/血管同轴3D打印思路，以实现血管+结构同步制造（图2）。通过设计核/壳型的GelMA/明胶墨水，利用同轴喷头将载组织细胞墨水(外喷头)和载内皮细胞牺牲墨水(内喷头)同时挤出，打印时牺牲墨水支撑流道，培养时牺牲墨水融化形成通畅的流道网络，同时内皮细胞从牺牲墨水中释放，粘附于流道内壁进行血管化，实现从流道网络到血管化网络的转变。基于此方法，实现了血管化大块组织结构（≥1 cm）的打印及体外长时间培养（≥20 days），并成功将其应用于血管化的肿瘤模型和骨组织的制造。

图2 血管+结构一次性打印原理

此外，在血管+结构的一次性打印策略中，由于载细胞墨水和牺牲墨水相互协同作用，相互增强了各自的可打印性，能够容易的实现复杂结构的打印。同时，由于实体结构的自支撑效应，可打印具有较高保证度的三维复杂结构，且在结构内的血管流道保持的较好（图3）。

图3 三维复杂血管流道网络结构打印

为了模拟生物体内细胞或细胞外基质组成多样性，我们还模拟制造了多细胞或多材料组织结构（图4、图5），采用多合一喷头装置，可以切换多种载细胞材料与牺牲材料进行同步打印。打印时，选择性的通入目标载细胞材料，同时通入牺牲材料，可以打印出含有血管流道的多组分组织结构体。

图4 多组分血管流道网络结构打印原理

图5 多组分血管流道网络结构

为了验证血管流道网络输送营养/氧气的有效性，，我们打印了cm级的含血管流道网络的大块载细胞结构体(10 mm × 10 mm × 10 mm)，并观察结构体不同部位的细胞生长状况（图6），细胞在整个流道网络结构内均可逐渐伸展、迁移并连接，验证了流道网络的传输营养/氧气的有效性。

图6 培养第6天时，乳腺癌细胞在结构内逐渐伸展并连接

随后我们验证了通过内皮细胞自动沉积生成血管化通道的可行性，经验证内皮细胞可以自沉积并粘附到血管流道内壁，并随着体外培养而增殖，最终覆盖并内皮化流道网络，形成功能化的内皮管腔。（图7）。

图7 内皮细胞自动沉积，可以有效的无死区的内皮化流道，同时内皮细胞在流道内增殖、伸展连接形成功能化的内皮管腔

最后基于血管+结构一次性打印策略，我们打印了血管化的肿瘤组织，癌细胞在血管化组织结构内伸展，连接，同时内皮细胞覆盖并内皮化流道网络，最终形成功能化的血管化肿瘤组织（图8）。

图8 血管化肿瘤组织

与此同时，随着长时间的培养，内皮细胞会产生血管新生芽朝向肿瘤组织内部生长（图9），而且癌细胞会逐渐向血管流道方向迁移（图10）。这些实验结果说明打印的血管化组织具有相应的生物功能，模拟出了肿瘤组织的血管化、迁移和侵袭等特性。

图9 血管出芽

图10 癌细胞迁移

  最后，我们还打印血管化骨组织（图11），再次验证血管化大组织打印策略的有效性，血管+结构一次性打印方法突破了大块组织的体外制造瓶颈。

图11 血管化骨组织

血管+结构一次性打印方法简单实用，可有效的，无死区的使复杂血管流道网络血管化，促进了细胞的存活、伸展、迁移、连接及血管化组织的新生。同时载细胞墨水和牺牲墨水同轴打印自支撑实体结构，使得复杂结构的制造更加容易。而且，采用多合一喷头，可实现多组分血管流道结构的打印，使得多细胞或多细胞外基质的组织结构制造成为可能。此外，打印的血管流道结构后续可通过灌流培养，进行实时灌流下的血管化组织发育成熟过程研究。血管+结构一次性打印方法特别擅长于大尺寸组织的体外重建。

相关论文“Directly Coaxial 3D Bioprinting of Large-scale Vascularized Tissue Constructs”近日刊登在Biofabrication杂志上。第一作者为邵磊博士生，通讯作者为贺永教授，傅建中教授，高庆博士为共同通讯。

论文地址：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab7e76

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 [A1]加引用地址