体外大尺寸组织重建的同步生物3D打印方法

78 Synchronous 3D Bioprinting of Large‐Scale Cell‐Laden Constructs with Nutr.pdf

【背景】组织/器官内的血供系统，为组织提供了必须的营养及代谢交换。而组织体外重建时当尺寸>200μm，就会超出营养/氧气的扩散极限，需要构造营养网络，避免内部营养输送不畅。目前体外重建最常见的思路是直接打印载细胞多孔结构（从以前的多孔支架打印发展过来），然而由于水凝胶强度弱，导致多孔结构易坍塌，尤其当尺度突破到cm量级时，内部多孔结构很难有效保持（图1A）。

为了在大尺寸组织中构造出有效的营养输送网络，我们提出了同步打印策略：即打印单元是一半是载细胞墨水一半是牺牲墨水的水凝胶丝，打印时牺牲单元也能起到支撑，避免打印时的坍塌，待牺牲墨水去除后，即可获得高质量流道网络（图1B）。据此我们实现了超过1cm尺寸活性结构的制造，结构具有高保真度的同时，保持了完整有效的流道网络，促进了细胞在大尺寸结构内发生类体内生长行为，如伸展、迁移、连接及组织新生等。

图1 A) 直接打印载细胞多孔支架及存在的问题 B) 我们设想的载细胞墨水与牺牲墨水同步打印策略及相应的优势

对于同步打印策略，载细胞墨水和牺牲墨水的选择至关重要。由于GelMA是Gelatin的改性物，生物/理化性能上有诸多相似性。因此，借助于Gelatin和GelMA共同的可逆温敏交联特性及GelMA的永久光交联特性，以及它们优越的生物性能，GelMA/Gelatin是作为载细胞材料/牺牲材料完美的同步打印材料组合。

为了实现同步打印GelMA/Gelatin，制造含有流道网络的结构，我们设计了二合一喷头，基于二合一喷头的营养流道同步打印策略分三步，如图2所示。第一步：将预凝胶化的明胶和GelMA分别通入二合一喷头，挤出一半明胶一半GelMA的丝，制造冷凝化临时三维结构；第二步：将临时结构置于蓝光下，永久光交联固化GelMA，定型结构。第三步：将打印结构放置在摇床上，37℃环境下动态培养，随之明胶溶解，流道网络形成，如图3所示。由于打印过程使用的是预凝胶化墨水，因此同步打印策略可以打印低浓度墨水，使制备的结构具有更高的孔隙率，更利于细胞的生长。

图2 营养流道网络同步打印策略原理

图3 同步打印流道网络结构实物图

通过调整不同的明胶和GelMA流量配比，可制备不同尺寸的流道网络结构，如图4所示。

图4 控制不同明胶和GelMA流量配比，制备不同尺寸的流道网络结构

此外，同步打印策略中，由于载细胞墨水和牺牲墨水相互协同作用，相互增强了各自的可打印性，能够容易的实现复杂结构的打印。同时，由于实体结构的自支撑效应，可打印具有较高保证度的三维复杂结构，且在结构内的流道网络保持的较好。如图5,6所示。

图5 二维复杂营养流道网络结构打印

图6 三维复杂营养流道网络结构打印

为了模拟生物体内细胞或细胞外基质组成多样性，我们还模拟制造了多细胞或多材料组织结构。如图7，8所示，采用多合一喷头装置，可以切换多种载细胞材料与牺牲材料进行同步打印。打印时，选择性的通入目标载细胞材料，同时通入牺牲材料，可以打印出含有流道网络的多组分组织结构体。

图7 多组分流道网络结构打印原理

图8 多组分三维营养流道网络结构

为了验证营养流道网络的有效性，能促进大尺寸组织结构的功能化，我们打印了含流道网络的大尺寸载细胞结构体(10 mm × 10 mm × 10 mm)，并观察结构体内的细胞生长状况，如图9,10所示，细胞在流道网络结构内逐渐伸展、迁移并连接，验证了流道网络的传输营养/氧气的有效性。

图9 培养第7天时，成骨细胞在流道网络结构内逐渐伸展并连接

图10 培养第7天时，内皮细胞在流道网络结构内逐渐伸展并连接

同步生物打印策略简单实用有效，促进了细胞的存活、伸展、迁移、连接及组织的新生等一系列类体内细胞生长行为。同时，载细胞墨水和牺牲墨水相互协同作用，增强了各自的打印性能，使得复杂结构的制造更加容易。而且，采用多合一喷头，可实现含流道网络的多组分结构的打印，使得多细胞或多细胞外基质的组织结构制造成为可能。此外，这种同步打印策略可以扩展至其他生物性能更优越的材料，如F127/胶原蛋白，F127/基质胶等。

相关论文“Synchronous 3D Bioprinting of Large-Scale Cell-Laden Constructs with Nutrient Networks”近日发表在Advanced Healthcare Materials杂志上。第一作者为邵磊博士生，通讯作者为贺永教授，浙二医院的项美香教授，高庆博士为共同通讯作者。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adhm.201901142