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肠杆菌素-抗生素偶联体：一种灭菌效果奇特的新型抗生素（修改稿）

诸平 

  抗生素抗药性是当代医学一个日益严重的现象，已成为21世纪超级重要的公共健康议题之一，特别是因为它涉及到有关引起人类疾病的病原微生物。在最简单的情况下，抗药性的有机体可能获得第一线抗生素的抵抗力，从而需要使用二线药物。通常，选用第一线药物是根据安全性、易取得和成本等因素的考量；二线药物则通常是广效的、具有不受欢迎的副作用，以及比较昂贵，或是情势急迫，局部没有效果。某些多重耐药性（MDR）病原体，相继获得第二、甚至第三线抗生素的抗药性，典型的情况如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的院内感染。某些病原体如绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）还具有高水平的内在抗药性。

但是，据美国化学会《化学与工程新闻》（C&EN）周刊网站2014年6月27日报道，美国麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology）化学系的郑腾飞（Tengfei Zheng音译）博士在导师伊丽莎白·诺兰（Elizabeth M. Nolan ，见图1）的指导下，他们将一种用于富集金属离子的天然产物肠杆菌素（enterobactin，见图2中红色部分）与一种β-内酰胺抗生素——氨苄青霉素(ampicillin,见图2中蓝色部分)连接在一起，形成了一种新型抗生素，可以直接进入细胞内，更有效地杀死大肠杆菌。相关研究结果已经于2014年6月13日在JACS网站发表——Tengfei Zheng，Elizabeth M. Nolan. Enterobactin-Mediated Delivery of β-Lactam AntibioticsEnhances Antibacterial Activity against Pathogenic Escherichia coli.J. Am. Chem.Soc., Publication Date (Web): June 13, 2014, DOI: 10.1021/ja503911p.

铁载体——运送抗生素的潜在工具

化学家努力开发应对革兰氏阴性细菌,如大肠杆菌（Escherichia coli）类的抗生素药物，因为在某种程度上,此类微生物细胞壁的特征与阳性菌种不同，有一层外层膜（outermembrane），是在肽聚糖层之外的膜，内含有脂多糖、核糖、O抗原等，此膜能转移药物分子。为了使杀灭微生物的药物在穿越细菌细胞屏障方面来去自如,研究者长期以来一直对于细菌产生的能够承载药物分子，并可以穿过细菌细胞防御的物质倍加关注，铁载体（siderophores）就是其中一种颇受关注的对象。

 铁是大多数生物生长所必需的元素，在生命活动中占有极其重要的地位。尽管自然界中铁元素含量丰富，但是大多数好氧生物包括微生物都面临着铁缺乏的问题。微生物需要铁元素合成细胞色素和酶类，而地球又是一个富氧的环境，自然界中的铁以氧化物形式存在，可以说极不可溶（extreme insolubility）。就是亚铁盐中的二价铁离子（Fe²⁺）因为稳定性不如三价铁离子（Fe³⁺）,也容易被空气中的氧气氧化为Fe³⁺，而是Fe³⁺及其衍生物多数溶解性较低，不易被微生物或者植物吸收利用。铁载体就可以解决这个问题。

 铁载体是一种在低铁条件下，微生物或植物合成并分泌的一类对三价铁离子（Fe³⁺）具有超强络合力的小分子量的有机化合物，专门将不易被植物、微生物吸收利用的铁元素转化为铁—铁载体复合物供植物和微生物摄取，方便利用。铁载体主要存在于微生物（细菌、真菌）之中，此外禾本科植物，如大麦、小麦等，也可以合成铁载体。虽然都称其为铁载体（siderophores），但是不同微生物中的铁载体结构不同（见：Mathias Wittenwiler. Mechanisms of Iron Mobilization by Siderophores. ETH Zürich，December 2007.）。铁载体包括氧肟酸盐型（hydroxamates）、儿茶酚盐型（phenolatescatecholates）和羧酸盐型（carboxylates）等。真菌往往合成氧肟酸盐型铁载体，如铁色素（ferrichrome）。大肠杆菌（Escherichia coli）则合成肠杆菌素（enterobactin），是儿茶酚盐型铁载体的一种。

  铁载体分子量在500～1500 Da之间，多为八面体构型，主要为异羟肟酸或者邻苯二酚衍生物。通常情况下，3个铁载体围绕一个铁离子形成一个通过配位价连接的八面体复合物，即铁—铁载体复合物。根据铁载体螯合基团的化学性质可将其分为4种类型，即异羟肟酸型、邻苯二酚型、羧酸盐型和混合型(详见：崔艳华，董爱军，曲晓军.微生物铁载体运输系统.生命的化学，2008，28（6）：786-790. )。通过这种复合物类型，铁载体可将铁离子带回到细胞之中。尽管许多研究人员试图利用铁载体来携带其它物质进入细菌细胞,但是其结果并不理想。

 铁载体复合物通过与细胞膜上的铁载体受体蛋白结合进入细胞。当有少量铁元素存在于培养基中时，微生物能够分泌铁载体。一旦铁—铁载体接触到细胞膜上的铁载体受体蛋白，或者铁原子直接释放到细胞质中，或者整个的铁—铁载体复合物通过ABC转运（ATP结合性盒式转运蛋白系统）进入细胞。在大肠杆菌中，铁载体受体在细胞壁膜的外膜上，当铁到达周质空间后在转运蛋白的帮助下进入细胞质。铁进入细胞质后被还原为二价铁（Fe²⁺, ferrous form），由于铁载体对三价铁的亲和力高于二价铁，所以Fe²⁺易于从铁载体上解离。

“改造”后的抗生素，特异性更强

2012年,诺兰和她的团队研究结果表明,他们可以利用肠杆菌素（enterobactin）将无毒分子承载运送到细胞内（见图3）——Tengfei Zheng , Justin L. Bullock, and Elizabeth M. Nolan. Siderophore-Mediated Cargo Delivery to the Cytoplasm ofEscherichia coli and Pseudomonas aeruginosa: Syntheses of MonofunctionalizedEnterobactin Scaffolds and Evaluation of Enterobactin–Cargo Conjugate Uptake.J. Am. Chem.Soc., 2012, 134 (44), pp 18388–18400. DOI: 10.1021/ja3077268.他们认为他们的成功是如何在铁载体上加载附加物:在不会扰乱肠杆菌素与铁的结合能力，或其与其目标受体的结合能力的位置，添加了一种链接剂分子。

他们在论文中介绍了单功能化的肠杆菌素包括l-异构体和d-异构体骨架的设计与合成。在此骨架中肠杆菌素含有苯酚基团（catecholatemoiety），而且在C5的位置有烯烃、醛或羧酸。这些分子都是10种肠杆菌素-载体偶联物（enterobactin–cargo conjugates）家族的主要前体，这样的设计是为了研究革兰氏阴性三价铁肠杆菌素（Gram-negative ferric enterobactin）吸收程度，以及处理器识别、传输和利用衍生的肠杆菌素骨架的程度。

使用肠杆菌素不足的大肠杆菌E. coli ATCC 33475所进行的一系列生长恢复检验结果显示，有相对较小的承载6种基于l-Ent的偶联物，在铁有限的条件下，提升了大肠杆菌的增长；但是有4种具有相对较大承载物的偶联体，对于大肠杆菌生长恢复的影响微乎其微。对于肠杆菌素受体缺乏的大肠杆菌菌株（E. coli H1187）或者是肠杆菌素酯酶缺乏的大肠杆菌衍生物（E. coli K-12 JW0576）而言，尚未看到大肠杆菌生长恢复迹象。当使用肠杆菌素d-异构体时也会出现类似情况。

这些结果表明,大肠杆菌对于铁-肠杆菌素的运输机识别和递送选择，与修饰过的骨架结构中的承载物R(cargo)有关。对肠杆菌素载体偶联物的摄入和利用以及8种偶联物在铁受限条件下观察其生长促进效果，绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa PAO1 K648)与大肠杆菌相比较，显得更加混乱。肠杆菌素可被用于传递分子的载体，通过运输机运送到大肠杆菌（ E. coli ）和绿脓杆菌（P. aeruginosa）的细胞质，因而为克服革兰氏阴性外膜通透性屏障提供一种手段。

 但是2年之后，诺兰和她指导的研究生郑腾飞合成了对肠杆菌素修饰的新结构，在其上连接了2种不同的β-内酰胺抗生素（β-lactam antibiotics）：氨苄西林（ampicillin）和阿莫西林（amoxicillin）。然后他们观察新抗生素在各种低铁条件下对大肠杆菌菌株的灭杀活性。

 对于抗生素-铁载体偶联物（antibiotic-siderophoreconjugates）来说，与未链接抗生素药物的结构相比较，所有的菌株都更容易受到影响。例如,对于尿路感染菌株CFT073,新化合物（抗生素-铁载体偶联物）比未链接抗生素的偶联物杀菌效果强1000倍（见图4）。郑腾飞和诺兰的进一步实验研究结果显示，FepA是参与肠铁素 Fe（Ⅲ）配合物运转及应用的5个基因产物（fepA、fepB、fesB、tonB 和 exbB）中的一个,它是细菌外膜中的一种传输铁载体（siderophores）的蛋白质，对连接的抗生素活性是至关重要的。

 美国圣母大学（University of Notre Dame）的马文·米勒（Marvin J. Miller ）说，并非只有MIT的科学家关注铁载体的研究，其他小组也将自己的注意力聚焦于此，关注铁载体与铁的紧密结合,但MIT科学家的研究表明，肠杆菌素的修饰并没有使铁载体和其受体之间的分子识别受到影响，这是尤为重要的。

 诺兰和郑腾飞还发现,这些偶联体并不具有广谱杀菌的强力活性。例如,在大肠杆菌CFT073（E. coli CFT073）和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（gram-positive Staphylococcusaureus）的混合培养液中,采用低浓度（1μM）的抗生素-肠杆菌素偶联物进行处理之后，金黄色葡萄球菌菌落还可以幸存，而大肠杆菌菌落就没有那么幸运。

 诺兰认为，这一种特异的杀戮性对于临床医生来说，最终可能是一种有用的工具。因为如果感染原因已知,医生便可以选择一种能够杀死致病菌的抗生素,同时保留有益菌株不受影响、茁壮成长。马文·米勒（Marvin J. Miller ）也补充说：这种新型抗生素选择灭杀细菌的潜力的确“令人兴奋,”“这种方法有助于我们在永无止境的微生物战争中保持领先一步的优势。”更多信息请浏览原文。

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