科学家绘制了单细胞分辨率下完整的人肠道细胞图谱

诸平

Fig. 1 Protein MUC5b (red) in crypt-resident goblet cells; MUC2 (green) in all goblet cells. Credit: Magness Lab, UNC School of Medicine

Fig. 2 Proteins CFTR (green) and FKBP1A (red) — a primary target of the drug Tacrolimus — in BEST4+ cells in small intestine. Credit: Magness Lab, UNC School of Medicine 

北卡罗莱纳大学（University of North Carolina简称UNC）2022年2月18日提供的消息，科学家绘制出首个单细胞分辨率下完整健康肠道的综合细胞图谱(Scientists map entire human gut at single cell resolution)。图1（Fig.1）是有UNC医学院麦格尼斯实验室（Magness Lab, UNC School of Medicine）提供的隐窝杯状细胞中的MUC5b蛋白(红色)以及在所有杯状细胞中的MUC2蛋白(绿色)。

如果你感到紧张，你可能会从内心感受到。如果你吃辣椒，你的肠胃可能会不舒服，但你的朋友可以吃任何东西，而且感觉很好。你可以像吃糖果一样服用布洛芬(ibuprofen)，没有任何副作用，但你朋友的服用布洛芬后可能会出现便血，也可能对缓解疼痛毫无效果。这是为什么呢?答案很简单，因为我们都是不同的个体。接下来的问题是到底有什么不同，这些差异对健康和疾病意味着什么?要回答这些问题并不那么容易，但是UNC医学院的斯科特·马格尼斯博士（Scott Magness, Ph.D.）实验室揭示了一些有趣的科学答案。相关研究结果于2022年2月14日已经在《细胞与分子胃肠病学与肝脏病学》（Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology）杂志网站发表——Joseph Burclaff, R Jarrett Bliton, Keith A Breau, Meryem T Ok, Ismael Gomez-Martinez, Jolene S Ranek, Aadra P Bhatt, Jeremy E Purvis, John T Woosley, Scott T Magness. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology, 2022 Feb 14; DOI: 10.1016/j.jcmgh.2022.02.007

参与此项研究的有来自美国北卡罗莱纳大学教堂山分校（University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill）、北卡罗莱纳州立大学（North Carolina State University）以及北卡罗莱纳大学医学院（University of North Carolina School of Medicine）的研究人员。

https://news.unchealthcare.org/2022/02/scientists-map-entire-human-gut-at-single-cell-resolution/

斯科特·马格尼斯实验室首次使用了来自三名器官捐赠者的整个人类胃肠道，以显示肠道所有区域的细胞类型如何不同，以阐明细胞功能，并显示这些细胞之间和个体之间的基因表达差异。这项研究以比以往任何时候都更精确的方式，以更高的分辨率，为探索肠道健康的许多方面打开了大门。

北卡罗来纳大学-北卡罗来纳州联合生物医学工程系的副教授，也是该论文的通讯作者斯科特·马格尼斯说：“我们的实验室表明，了解每种细胞类型在重要过程中的功能是可能的，比如营养吸收、防止寄生虫、粘液和调节饮食行为和肠道运动的激素的产生。我们还了解了肠道内壁如何通过受体和传感器与环境相互作用，以及药物如何与不同类型的细胞相互作用。”

敏感的肠道（The sensitive gut）

想想一个典型的制药商业配音，当配音演员愉快地说出可能的副作用，如腹泻、呕吐、肠道出血和其它令人不快的副作用。斯科特·玛格尼斯实验室正试图了解为什么这些副作用会发生，深入到单个细胞的水平，它们的功能，它们的位置和它们的基因。

在这项研究中，斯科特·玛格尼斯实验室将重点放在了上皮细胞上:这是一层单细胞厚层，它将肠道和结肠内部与其它东西隔开。和其它细胞群和微生物群一样，上皮细胞对人类健康非常重要，多年来科学家一直在探索它。但到目前为止，研究人员只能从消化道的几个部分，通常是结肠或小肠的有限区域，进行米粒大小的微小活组织检查。

斯科特·马格内斯说:“这种探索就像从太空观察美国，但只研究马萨诸塞州（Massachusetts）、俄克拉荷马州（Oklahoma）和加利福尼亚州（California）的情况。为了真正了解这个国家，我们想要看到全部，而不是局部。”

斯科特·马格尼斯主要依靠自己实验室的博士后研究者约瑟夫·伯克拉夫博士（Joseph Burclaff, Ph.D.）和研究生贾勒特·布里顿（Jarrett Bliton）完成上述工作，他们二位都是共同第一作者。

约瑟夫·伯克拉夫说:“我们不仅想要确定细胞的位置，而且我们想要确切地知道哪些细胞类型做什么，以及为什么。所以，坚持地图类比，我们不想只是说，‘哦，这是北卡罗莱纳州’。我们想知道哪里可以吃到最好的烤肉。我们希望从地面的角度尽可能多地了解情况。”

在过去，研究人员会将这些米粒大小的活组织切片混在一起，以识别所有上皮细胞类型，并了解这些细胞的一些一般特征。斯科特·马格尼斯的方法是从下消化道(小肠和结肠)的每个部分取样数千个单个细胞，创建一个图谱，然后通过每个细胞表达的基因来研究这些细胞的潜在作用。了解所有这些将加深对肠道上皮细胞的科学知识，并有望鼓励其他科学家探索每个细胞在生物学、疾病和药物副作用的不幸场景中的功能。

为了进行如此深度的单个细胞潜水，斯科特·马格尼斯需要两件事:更好的技术和整个人类的消化道。

数据的生物学（The biology of data）

北卡罗莱纳大学教堂山分校（UNC-Chapel Hill）获得先进的核糖核酸测序技术，几年前通过UNC胃肠道疾病和生物学中心（UNC Center for Gastrointestinal Disease and Biology），创建了高级分析核心设施（Advanced Analytics Core Facility），它发展了科学和智力的重要性，使研究人员、职员、博士后和研究生方便使用最先进的设备。

斯科特·马格尼斯研究小组通过与HonorBridge器官捐赠服务机构的一项研究协议获得了人类消化道。当肠道被采集用于移植时，如果它们没有被更优先的群体认领，HonorBridge的工作人员会与斯科特·马格尼斯研究小组协调，将移植级器官捐赠给其供研究使用。

在收采后6~8 h，斯科特·马格尼斯实验室接收完整的肠道，每个大约4.5~9 m(15~30 feet)长。他们去除上皮细胞层，这是一个长连接的组织，尽管只有一个细胞厚。然后，研究人员使用酶将上皮细胞分解成单个细胞。在这项研究中，他们对来自3个不同捐赠者的器官重复了这一过程。图2（Fig. 2）是由北卡罗莱纳大学医学院斯科特·马格尼斯实验室提供的，小肠BEST4+细胞中CFTR(绿色)蛋白和FKBP1A(红色)蛋白-药物他克莫司（Tacrolimus）的主要靶点。

斯科特·马格尼斯团队利用测序技术来表征基因表达特征，首先从每个细胞中提取RNA，同时保持每个细胞的分离，然后进行单细胞测序，这就获得了每个肠道细胞表达的基因和表达量。

斯科特·马格尼斯说:“我们从每个细胞获得的图像是细胞制造的所有不同类型基因的马赛克(mosaic)，这些基因的补充创造了一个‘签名’，告诉我们它是什么类型的细胞，以及它可能在做什么。它是一个干细胞、粘液细胞（mucous cell）、分泌激素细胞（hormone-producing cell）还是一个发送免疫信号细胞（immune-signaling cell）?”

约瑟夫·伯克拉夫补充说，“我们能够看到整个消化道细胞类型的差异，我们可以看到3个不同的人在相同的细胞类型中不同的基因表达水平。我们可以看到不同组的基因在单个细胞中开启或关闭。例如，这就是我们如何开始理解为什么有些人对某些食物或药物产生毒性，而有些人没有。”

这类研究的一个主要问题是产生的巨量数据。单细胞测序可以获得大约11000条“reads”，也就是在一个细胞和成千上万个细胞中获得的基因产物的个体样本，每个细胞都有20000多个开启或关闭的人类基因的不同组合。这为研究中的12590个细胞创造了近1.4亿个数据点，这些数据点必须被转换成可视化的格式，这样科学家才能理解大量的信息。

斯科特·马格尼斯说:“人类的大脑只能理解二维空间，三维空间就很有挑战性了。加上时间，理解单个细胞的作用就更加困难了。我们的实验产生的数据量基本上是同时数百万个维度。”

贾勒特·布里顿设计的计算技术来过滤数据，以产生一个可管理的数据集，其中包括来自胃肠道所有部分的细胞种群。然后，根据斯科特·马格尼斯和其他研究人员对每种细胞类型的了解，贾勒特·布里顿可以计算出每个区域的每种细胞类型。然后他以人类能够理解和解释的方式绘制了这些数据。

掌握了大量的数据后，科学家们对每种细胞类型都有了更多的了解。想想40年前发现的一簇细胞（tuft cell），之所以这样命名，是因为它们的表面似乎有一簇毛发。结果发现，这些簇细胞表达的基因与舌头味蕾上的基因相似。其他研究人员发现，这些簇细胞感知蠕虫感染，并向免疫系统发送信号，开始发动围剿。斯科特·马格尼斯实验室显示，簇细胞显示出一组被认为对感知和“品尝”其它肠道内容物很重要的基因，因此在需要时它可以向免疫系统发出信号。这将代表一个更广泛的功能，而不是检测你的肠道是否有寄生虫。

约瑟夫·伯克拉夫说：“我们不仅描述了每一种细胞类型和它们单独表达的每一个基因，而且还观察了潜在的功能。如果你观察肠粘液，这是一种保护细胞的复杂混合物，我们可以显示哪些细胞表达了各种粘蛋白，有多少，以及在消化道的哪个区域。我们研究了消化食物的特定酶在哪里表达。我们观察了具有抗炎基因表达和突触基因的细胞，肠道可能与神经相连，因此它可以与身体其它部分对话。我们研究了水通道蛋白（aquaporins），这是一种通过肠膜传递水分的蛋白质。”

斯科特·马格尼斯团队发现，潜在功能的变化达到了一个全新的水平，这是以前通过混合活检样本所没有发现的。

研究人员探索了所有上皮受体（epithelial receptors），即用于与其它细胞和分子以及肠道环境沟通的细胞表面蛋白。斯科特·玛格尼斯和同事们可以看到哪些受体表达得最多，哪些细胞类型表达得最多，从而为细胞如何与肠道内容物(如营养物质、微生物、毒素和药物)相互作用绘制了一幅新画面。

贾勒特·布里顿说:“据我们所知，我们是第一个从3个完整的捐赠者身上对人类肠道长度进行这种分析的人。我们可以观察每一种细胞类型，并预测哪种药物可能单独影响哪种细胞类型。”

例如，有一类药物可以治疗炎症性肠病;它们被设计用来攻击特定的目标，某些诱发炎症的免疫细胞。但斯科特·玛格尼斯实验室发现，一些上皮细胞表达的基因与免疫细胞中表达的基因相同，而免疫细胞正是目标细胞。这一发现表明上皮细胞可能存在非预期的“脱靶”效应（"off-target" effects），并可能导致副作用。

“这是不知道的，”约瑟夫·伯克拉夫说，“许多药物对胃肠道有不良的副作用。这可能是因为药物影响了整个胃肠道的单个细胞。我们展示了这些受体在哪些细胞类型中表达得最多。”

这类知识只是斯科特·玛格尼斯实验室最初研究的结果之一。

斯科特·玛格尼斯说:“我们希望科学界、医学界和医药界使用我们的发现。我们采用了一种分析方法来有条不紊地处理每一种细胞类型，为大多数科学家制作了易于阅读和可访问的电子表格，并展示了几个例子，说明我们可以通过这种高分辨率、精确的方法发现什么。”

除了上述的研究人员，其他的作者都来自北卡大学教堂山分校（UNC-Chapel Hill）。

上述介绍，仅供参考，欲了解更多信息，敬请注意浏览原文或者相关报道。

Abstract

Background and aims: Single-cell transcriptomics offer unprecedented resolution of tissue function at the cellular level, yet studies analyzing healthy adult human small intestine and colon are sparse. Here, we present single-cell transcriptomics covering the duodenum, jejunum, ileum, and ascending, transverse, and descending colon from 3 humans.

Methods: 12,590 single epithelial cells from three independently processed organ donors were evaluated for organ-specific lineage biomarkers, differentially regulated genes, receptors, and drug targets. Analyses focused on intrinsic cell properties and capacity for response to extrinsic signals along the gut axis across different humans.

Results: Cells were assigned to 25 epithelial lineage clusters. Multiple accepted intestinal stem cell (ISC) markers do not specifically mark all human ISCs. Lysozyme expression is not unique to human Paneth cells, and Paneth cells lack expression of expected niche-factors. BEST4+ cells express NPY and show maturational differences between small intestine and colon. Tuft cells possess a broad ability to interact with the innate and adaptive immune systems through previously unreported receptors. Some classes of mucins, hormones, cell-junction, and nutrient absorption genes show unappreciated regional expression differences across lineages. Differential expression of receptors and drug targets across lineages reveals biological variation and potential for variegated responses.

Conclusions: Our study identifies novel lineage marker genes; covers regional differences; shows important differences between mouse and human gut epithelium; and reveals insight into how the epithelium responds to the environment and drugs. This comprehensive cell atlas of the healthy adult human intestinal epithelium resolves likely functional differences across anatomical regions along the gastrointestinal tract and advances our understanding of human intestinal physiology.