几种对2019-nCoV有效的药物简介

诸平

2020年2月4日，中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室、中国科学院(武汉)生物安全大科学中心以及北京药理毒理研究所急诊药物国家工程研究中心的研究人员，对于瑞德昔韦（Remdesivir）和氯喹（chloroquine）在体外有效抑制最近出现的新型冠状病毒（2019-nCoV）研究结果，寄给《细胞研究》（Cell Research）编辑部，2020年1月25日收到，28日接受，一周之后以作者来信的方式在《细胞研究》杂志网站发布——Manli Wang, Ruiyuan Cao, Leike Zhang, Xinglou Yang, Jia Liu, Mingyue Xu, Zhengli Shi, Zhihong Hu, Wu Zhong, Gengfu Xiao. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro（Open Access）. Cell Research, Published: 04 February 2020. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0282-0.现将此信编译如下，仅供参考。

亲爱的编辑，

2019年12月，在中国中部1100万人口的城市武汉，出现了一种由先前未知的病原体引起的新型肺炎。最初的病例与武汉海产品市场的暴露有关。截至2020年1月27日，据报导中国大陆2835例确诊病例，包括81例死亡。此外，在香港，澳门和台湾发现了19例确诊病例，在泰国、日本、韩国、美国、越南、新加坡、尼泊尔、法国、澳大利亚和加拿大发现了39例进口病例。该病原体很快被鉴定为新型冠状病毒（2019-nCoV），与严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）密切相关。目前，尚无针对新病毒的特殊治疗方法。因此，迫切需要找到有效的抗病毒药物来对抗这种疾病。

药物发现的有效方法是测试现有的抗病毒药物是否有效治疗相关的病毒感染。2019-nCoV属于β-冠状病毒（Betacoronavirus），也包含SARS-CoV和中东呼吸综合征CoV（MERS-CoV）。SARS或MERS患者使用了几种药物，例如利巴韦林（ribavirin）、干扰素(interferon)、洛匹那韦-利托那韦(lopinavir-ritonavir)、皮质类固醇(corticosteroids), 尽管某些药物的疗效尚存争议。在这项研究中，我们评估了5种经过FAD批准的药物对临床分离的2019-nCoV的抗病毒效力，其中包括利巴韦林(ribavirin)、喷昔洛韦（penciclovir）、硝唑尼特（nitazoxanide）、那法莫司(nafamostat)、氯喹(chloroquine)和两种著名的广谱抗病毒药物瑞德昔韦（remdesivir, GS-5734）和法维吡韦（favipiravir, T-705）。

通过标准测定以测量这些化合物对2019-nCoV的细胞毒性，病毒产量和感染率的影响。首先，通过CCK8分析确定候选化合物在Vero E6细胞（ATCC-1586）中的细胞毒性。然后，将Vero E6细胞感染nCoV-2019BetaCoV /武汉/ WIV04 / 2019 。在不同浓度的受试药物存在下，感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0.05。在对照中使用DMSO。通过定量实时反转录酶-聚合酶链锁反应（quantitative real-time RT-PCR, qRT-PCR），其中RT-PCR的全称为反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction）。定量细胞上清液中的病毒拷贝数来评估功效，并在感染后（p.i.）48小时经免疫荧光显微镜通过可视化病毒核蛋白（virus nucleoprotein, NP）的表达进行确认。（细胞病变的影响在这个感染的时间点不明显）。在这7种受试药物中，高浓度的3种核苷类似物包括利巴韦林{半数最大有效浓度（EC₅₀）= 109.50 μM，半数细胞毒性浓度（CC₅₀）>400 μM，选择性指数（SI）>3.65}，喷昔洛韦（EC₅₀=95.96 μM，CC₅₀>400 μM，SI> 4.17）和法维吡韦（EC₅₀=61.88 μM，CC₅₀> 400 μM，SI>6.46）才能减少病毒感染（详见图  1a和补充信息图S1）。然而，尽管它在Vero E6细胞中的EC₅₀值高达67 μM，但已显示出法维吡韦在保护小鼠抗埃博拉病毒攻击方面具有100％的有效性，提示建议进行进一步的体内研究以评估这种抗病毒核苷。那法莫司是一种有效的MERS-CoV抑制剂，可防止膜融合，可抑制2019-nCoV感染（EC₅₀=22.50 μM ，CC₅₀> 100 μM，SI>4.44）。硝唑尼特是一种具有商业潜力的原生动物药物，具有针对多种病毒的抗病毒潜力，包括人和动物冠状病毒，可在低微摩尔浓度下抑制2019-nCoV（EC₅₀=2.12 μM ; CC₅₀>35.53 μM; SI>16.76）。建议对该药物针对2019-nCoV感染进行进一步的体内评估。值得注意的是，两种化合物瑞德昔韦（EC₅₀=0.77 μM ; CC₅₀>100 μM; SI>129.87）和氯喹（EC₅₀=1.13 μM ; CC₅₀>100 μM，SI> 88.50）在低微摩尔浓度下可有效阻断病毒感染。并显示出较高的SI（图  1a，b）。

图1：测试药物对2019-nCoV的体外抗病毒活性

Fig. 1: The antiviral activities of the test drugs against 2019-nCoV in vitro.

a Vero E6 cells were infected with 2019-nCoV at an MOI of 0.05 in the treatment of different doses of the indicated antivirals for 48 h. The viral yield in the cell supernatant was then quantified by qRT-PCR. Cytotoxicity of these drugs to Vero E6 cells was measured by CCK-8 assays. The left and right Y-axis of the graphs represent mean % inhibition of virus yield and cytotoxicity of the drugs, respectively. The experiments were done in triplicates. b Immunofluorescence microscopy of virus infection upon treatment of remdesivir and chloroquine. Virus infection and drug treatment were performed as mentioned above. At 48 h p.i., the infected cells were fixed, and then probed with rabbit sera against the NP of a bat SARS-related CoV² as the primary antibody and Alexa 488-labeled goat anti-rabbit IgG (1:500; Abcam) as the secondary antibody, respectively. The nuclei were stained with Hoechst dye. Bars, 100 μm. c and d Time-of-addition experiment of remdesivir and chloroquine. For “Full-time” treatment, Vero E6 cells were pre-treated with the drugs for 1 h, and virus was then added to allow attachment for 2 h. Afterwards, the virus–drug mixture was removed, and the cells were cultured with drug-containing medium until the end of the experiment. For “Entry” treatment, the drugs were added to the cells for 1 h before viral attachment, and at 2 h p.i., the virus–drug mixture was replaced with fresh culture medium and maintained till the end of the experiment. For “Post-entry” experiment, drugs were added at 2 h p.i., and maintained until the end of the experiment. For all the experimental groups, cells were infected with 2019-nCoV at an MOI of 0.05, and virus yield in the infected cell supernatants was quantified by qRT-PCR c and NP expression in infected cells was analyzed by Western blot d at 14 h p.i.

瑞德昔韦（Remdesivir）最近被公认为是针对培养细胞中感染小鼠和非人类灵长类动物（NHP）模型中的各种RNA病毒（包括SARS / MERS-CoV ）的有前途的抗病毒药物。当然也包括目前正在临床治疗埃博拉病毒感染。瑞德昔韦（Remdesivir）是一种腺苷类似物，可整合到新生的病毒RNA链中并导致过早终止。我们的加药时间分析表明瑞德昔韦在病毒进入后的一个阶段起作用（图  1c，d），这与其作为核苷酸类似物的推定抗病毒机制相符。沃伦（Warren）等人的研究结果表明，在NHP模型中，静脉内施用10 mg / kg剂量的瑞德昔韦可导致其活性形式在血液中持续存在水平（10 μM），并提供100％的埃博拉病毒感染防护。我们的数据显示，Vero E6细胞中瑞德昔韦相对于2019-nCoV的EC₉₀值为1.76 μM，这表明它可能在NHP中达到其工作浓度。我们的初步数据（补充信息，图  S2）显示，雷德昔韦还可以有效抑制人细胞系（人肝癌Huh-7细胞）中的病毒感染，该细胞系对2019-nCoV敏感。

氯喹是一种广泛使用的抗疟疾和自身免疫性疾病药物，最近被报道为潜在的广谱抗病毒药物。氯喹通过对病毒/细胞融合所需的增加体pH，以及与SARS-CoV病毒的细胞受体的糖基化的干扰已知块病毒感染。我们的添加时间分析表明，氯喹在Vero E6细胞中2019-nCoV感染的进入阶段和进入后阶段均起作用（图  1c，d）。除了其抗病毒活性外，氯喹还具有免疫调节活性，可在体内协同增强其抗病毒作用。口服后，氯喹广泛分布于整个身体，包括肺。在Vero E6细胞中，氯喹对2019-nCoV 的EC₉₀值为6.90 μM，如接受500 mg给药的类风湿关节炎患者的血浆中所示，临床上可达到。氯喹是一种便宜且安全的药物，已经使用了70多年，因此，它可能在临床上适用于2019-nCoV。

我们的发现表明，雷德昔韦和氯喹在体外控制2019-nCoV感染方面非常有效。由于这些化合物已用于具有安全跟踪记录的人类患者，并且显示出对各种疾病的有效效果，因此我们建议应在患有新型冠状病毒疾病的人类患者中对它们进行评估。瑞德昔韦(Remdesivir)治疗新型冠状病毒（2019-nCoV）肺炎的临床试验，于2020年2月3日在北京中日友好医院启动。因为它在美国的一起案例中被证明对新型冠状病毒感染的肺炎有效。

阿比朵尔（arbidol）临床实验

2020年1月25日在中南大学湘雅医院将其用于2019-nCoV临床实验。此目的是观察阿比朵尔治疗2019年新型冠状病毒(2019- nCoV)患者的疗效和安全性。根据随机双盲对照临床试验原则，将2019-nCoV患者分为三组。三组患者分别给予阿比朵尔200 mg/次、3次/日或阿比朵尔400 mg/次、3次/日或对照不用此药，各5天。三组患者其他抗病毒及综合治疗方法均一致。然后，调查人员将比较第一个结果:28天死亡率，和第二个结果:ICU住院时间、机械通气时间、住院费用、抗生素使用费用、SOFA评分、CURB-65评分、APACHE评分和其他临床指标。临床试验设计如下：

Study Design

阿比朵尔相关信息（来自网络）

阿比朵尔是一种抗病毒药物，由前苏联药物化学研究中心研制开发，主要适应症是A类、B类流感病毒引起的流行性感冒，同时对其他一些呼吸道病毒感染可能也有抗病毒活性。阿比朵尔的化学名称为6-溴-5-羟基-1-甲基-4-((二甲基氨基)甲基)-2-(苯基硫甲基)-1H-吲哚-3-甲酸乙酯{Ethyl 6-bromo-5-hydroxy-1-methyl-4-((dimethylamino)methyl)-2-[(phenylthio)methyl]-1H-indole-3-carboxylate}。用量为成人一次口服2粒(200 mg)，每日3次，连服用5日。此药不良反应事件发生率约为6.2%，主要表现为恶心、腹泻、头昏和血清转氨酶增高。对于儿童而言，根据文献资料报道，在俄联邦，阿比朵尔可用于2岁以上儿童的流感治疗。但是我国尚无相关儿童临床研究数据。对于妊娠与哺乳期女性以及年龄在65岁以上的老年人而言，其疗效与安全性尚不明确。

阿比朵尔药理作用及临床应用

阿比朵尔通过抑制流感病毒脂膜与宿主细胞的融合而阻断病毒的复制。研究显示，阿比朵尔体外细胞培养可直接抑制甲、乙型流感病毒的复制，体内动物试验可降低流感病毒感染小鼠的死亡率。其有干扰素诱导作用。

阿比朵尔适用于成人和儿童甲型流感、乙型流感、急性病毒性呼吸道感染、严重的急性呼吸道疾病综合征，包括并发支气管炎和肺炎的预防和治疗。在流感发病后早期使用盐酸阿比朵尔，可以明显缩短疾病的持续时间，减轻症状的严重程度，对于改善流感患者咳嗽、头痛、发热、发冷、出汗、咽喉痛、肌肉酸痛和疲劳等症状有明显作用，且安全性好，适合临床推广使用。用法及用量:100 mg/粒，口服，13岁以上儿童及成人每次2粒，6~12岁儿童每次1粒，2~6岁口服50mg。治疗:每天3次，服用3~5d。预防:流感流行期每3天服1次，连服3周;接触患者的高危人群每天服1次，连服2周。

阿比朵尔在俄罗斯、乌克兰等国家已有10余年的临床应用经验，被俄罗斯国家药典委员会推荐给成年人和儿童作为甲型流感病毒和乙型流感病毒的治疗药和预防药。Leneva等报道500名患急性病毒性呼吸道感染的患儿接受阿比朵尔临床研究，有效率约为84.8%，阿比朵尔能使发热、中毒和呼吸道炎症的持续时间缩短，症状减轻，使病毒抗原从鼻咽部释放的时间缩短，临床效果良好。王孟昭等在评价本品对自然获得性流感的安全性和有效性的随机双盲安慰剂对照的临床研究中，选取232例18~65岁、流感症状36h、体温在37.8℃以上的受试者，其中按照规定服用药物并完成所有随访且实验室检查证明为流感病毒感染的病例125例，随机分为两组，实验组PPi病例59例，对照组为66例，服用0.2 g本品，每天3次，服用5d，结果表明，实验组的疾病缓解率高于对照组。232例可用于安全性分析，实验组113例，对照组119例，共有20例不良事件可能与该药有关，其中，实验组7例(6.19%)，对照组13例(10.90%)，两组差异无统计学意义(P>0.05)，表明本品在流感发病后早期使用可以缩短疾病的持续时间，减轻症状的严重程度。

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