【本博文围绕Tushar Jain及其同事发表的论文“Biophysical properties of the clinical-stage antibody landscape” （http://www.pnas.org/content/114/5/944.abstract），旨在给计算科学工作者就生物物理实验方法做一个非常基础的介绍。】

在抗体药物研发中，一个主要的关切是：如何在筛选阶段就能够预测其可开发性上的问题，从而避免代价高昂的开发死胡同。这些问题的例子包括：抗体难于生产，药效或药代动力学不合适，贮存和在体内易于聚集，高免疫原性。本贴给最为常用的评估候选抗体可开发性的生物物理实验方法做了简明扼要的总结。

1. 易于生产

HEK滴定（HEK Titre, HEKt）：该方法测定抗体表达水平，越高越好。抗体重链和轻链序列亚克隆到载体中（如赛默飞的pcDNA 3.4+），这些载体随后转染人胚胎肾脏细胞（HEK293）悬液。经过一定天数后，收集上清测定表达程度。

2. 三维结构稳定性

差示扫描荧光测定解链温度（Melting temperature using Differential Scanning Fluorimetry, Tm with DSF）：该方法测定了抗体的热稳定性。抗体的热稳定性越高，就越少自发去折叠而产生免疫原性。抗体与染料如SPYRO橙混合，当该染料与疏水区域结合时会发荧光。将混合物置于一定范围的温度下，如从40°C到95°C，温度变化速度为每两分钟0.5°C。随着蛋白去折叠，埋藏在内部的疏水残基开始暴露，荧光强度将急遽增强。当荧光强度增加达到峰值时的温度即为其Tm值（进阶阅读：http://www.beta-sheet.org/resources/T22-Niesen-fingerprinting_Oxford.pdf）。

3. 粘性类测试方法（聚集倾向、低溶解度、高粘度）

亲和捕获自相互作用纳米颗粒光谱（Affinity-capture Self-interaction Nanoparticle Spectroscopy, AC-SINS）：该方法测定抗体与其自身相互作用的可能性。使用抗Fc抗体包被的金纳米颗粒，加入稀释的抗体溶液，抗体迅速被固定到金纳米颗粒表面。如果这些抗体随后发生自身相互作用，将导致金纳米颗粒间距离变短，用光谱仪能可检测到最大吸收光谱波长变长（进阶阅读：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24492294）。

克隆自相互作用生物膜干涉测定（Clone Self-interaction by Bio-layer Interferometry, CSI-BLI）：这是一种无标记的、更高通量测定自身相互作用的方法。将抗体装载到生物传感器吸头上，白光射过产生内部反射干涉图案。将吸头插入含有同样抗体的溶液，如果发生自身相互作用，干涉图案发生与生物膜厚度变化成比例的移动（进阶阅读：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3896597/）。
   
   图片来自：http://www.fortebio.com/bli-technology.html

疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）：将抗体混入极性流动相中再通过疏水柱子。然后使用紫外吸光度或其他技术测定吸附度（进阶阅读：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4094424）。

直立单层色谱（Standup Monolayer Chromatography, SMAC）：将抗体注入预先装好的Zenix高效液相柱子并计算其滞留时间。时间越长提示其胶体稳定性越差，更容易聚集（进阶阅读：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4622974/）。

体积排除色谱（Size-exclusion Chromatography, SEC）：抗体流过装满球形珠子的柱子。珠子有微孔。没有聚集的抗体小，进入珠子；而聚集的抗体会更快捷地流过柱子。根据先后流出部分的量可计算出聚集百分比。

4.特异度

交叉作用色谱（Cross-Interaction Chromatography, CIC）：该方法测定一种抗体流过偶联了人血清多克隆抗体的柱子的滞留时间。花的时间越长，提示该抗体表面可能与几种不同的体内靶标相互作用。（进阶阅读：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3896597/）。

与常见抗原或杆状病毒颗粒的酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）：将常见抗原或杆状病毒颗粒固定到固相表面，加入酶标记（如辣根过氧化物酶）的待测抗体的溶液。孵育约1个小时后洗去没有结合的抗体。加入合适的酶底物，激发可检测的可见颜色、荧光或化学发光。其强度与吸附到表面的的抗体成正比（进阶阅读：https://www.thermofisher.com/uk/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-elisa.html）。

多特异性试剂结合试验（Poly-Specificity Reagent Binding Assay, PSR）：一种使用流式细胞荧光分选技术的更高通量的方法。将可溶性膜蛋白（例如，来自中国仓鼠卵巢细胞）生物素化后制备成多特异性试剂，然后与酵母展示的IgG孵育。清洗后加入再次标记混合物。通过流式细胞术确定平均荧光强度。越高提示非特异结合的可能性越大（进阶阅读：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24046438）。

【黄子按曰】：英国动画片《小猪佩奇》风靡我国。本文是关于抗体可开发性实验筛选方法的简单介绍，翻译自牛津大学的牛津蛋白质信息学小组（Oxford Protein Informatics Group, OPIG）的组会张贴。原文网址为https://www.blopig.com/blog/2017/07/antibody-developability-experimental-screening-assays/。这个小组挺有意思，姑妄呼之：小猪小组吧。读后感觉差点又被博士生忽悠了。同学，你有没有仔细读呀！哪有这样骗老师的！信口开河要不得呀！