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[转载]阴道微生物群失调作为检测不孕女性慢性子宫内膜炎的新型非侵入性生物标志物
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慢性子宫内膜炎(Chronic endometritis, CE)是一种慢性非特异性的子宫内膜炎症性疾病，常表现为无症状或非特异性临床症状，慢性子宫内膜炎经常被患者和妇科医生忽略。因此，寻找新的诊断标记对于改善慢性子宫内膜炎的预后至关重要。
针对上述问题，来自武汉大学人民医院生殖医学中心杨静团队的科研人员在《OBSTETRICS AND GYNECOLOGY》上发表了研究论文。
该研究针对慢性子宫内膜炎女性的阴道微生物特征进行深入研究，比较了98名接受子宫内膜活检进行不孕症常规临床检查的女性（49名诊断为CE的女性和49名非CE的女性）的阴道微生物组特征，并采用杭州谷禾核酸提取试剂盒及测序平台，使用16S rRNA基因扩增子测序分析阴道微生物组，对微生物标记物进行了鉴定。
该项研究确定了四个慢性子宫内膜炎的微生物标记物（肠杆菌，普雷沃氏菌，粪杆菌，Phascolarctobacterium），开发了针对慢性子宫内膜炎预测诊断分类器，并进一步探讨了阴道微生物组特征作为慢性子宫内膜炎诊断新工具的潜力。
英文题目：Vaginal microbiome dysbiosis as a novel noninvasive biomarker for detection of chronic endometritis in infertile women
中文题目：阴道微生物群失调作为检测不孕女性慢性子宫内膜炎的新型非侵入性生物标志物
期刊名：OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
发表时间：2024年7月10日
研 究 背 景▼ 什么是慢性子宫内膜炎？
慢性子宫内膜炎是发生在子宫内膜间质区的持续性细微炎症性疾病，其特征为子宫内膜间质区的浆细胞浸润，通常无症状或仅出现轻微的症状，如异常子宫出血、盆腔疼痛、白带增多等。
▼ 慢性子宫内膜炎有哪些不良后果？
大量研究表明，慢性子宫内膜炎与女性不孕症、反复流产、反复着床失败、子宫内粘连和辅助生殖技术的不良后果密切相关，此外慢性子宫内膜炎还是影响活产和足月分娩的客观因素之一。
▼ 慢性子宫内膜炎的发病率
慢性子宫内膜炎的发病率在不同人群中不尽相同：
一般人群中的慢性子宫内膜炎患病率不明确，约0.8%~27.1%
慢性子宫内膜炎在不孕患者中的患病率为 2.8%~30%
而在不明原因复发性流产或反复着床失败的患者中高达67.5%。
其病理改变与内膜中微生物群的定性、定量改变有关。
近年来，人类微生物组学的研究表明，人体不同系统内微生物群与人类健康和疾病发病机制存在密切关系，刺激炎症并增加癌症等疾病发生的风险。作为人体主要的微生物组，阴道菌群对于女性生理和生殖健康起着重要作用。
◆阴道病原体感染是慢性子宫内膜炎的病因之一
Moreno等人通过微生物培养在慢性子宫内膜炎女性子宫内膜中发现了包括无乳链球菌和淋病奈瑟菌在内的细菌，并开发了一种诊断慢性子宫内膜炎的分子方法——逆转录聚合酶链反应试验，从这些病原体中识别DNA，用于慢性子宫内膜炎的诊断。
◆慢性子宫内膜炎：宫腔内致病菌增加
随着微生物组学技术的发展，传统观点认为宫腔内是无菌环境的观念也逐渐被推翻。16S和宏基因组测序等技术均证实宫腔内存在微生物的定植，健康女性以乳杆菌属占绝对优势，且宫腔内微生物与慢性子宫内膜炎的发病存在关联，慢性子宫内膜炎患者宫腔非乳酸杆菌为优势菌群且致病菌如加德纳菌、葡萄球菌、链球菌检出率增加。
在研究中也指出，诊断患有慢性子宫内膜炎的女性阴道微生物群生态失调。与子宫内膜冲洗样品相比，阴道分泌物可以作为诊断慢性子宫内膜炎的更无创和更经济有效的生物标志物。阴道宫颈黏液的免疫学指标已被认为是子宫内膜炎的潜在诊断生物标志物。然而，需要进一步评估阴道微生物组在慢性子宫内膜炎中的诊断潜力。
材 料 与 方 法本研究于2023年6月至2023年11月在武汉大学人民医院生殖医学中心完成。研究集中于常规不孕症检查中接受子宫内膜活检的患者。最终共纳入49名患有慢性子宫内膜炎的女性，并与49名非慢性子宫内膜炎对照组相匹配。
◆ 实验对象慢性子宫内膜炎患者的选择标准如下:
1) 年龄在20~40岁之间;
2) 诊断为不孕症，定义为35岁以下妇女至少12个月未能怀孕，35岁及以上妇女至少6个月未能怀孕;
3) 阴道分泌物正常，通过手术前Nugent评分0至3分证实;
4) 根据促黄体生成素激增后7天子宫内膜活检的组织病理学结果，在随机选择的30个高倍视野中至少一个视野中有5个以上的MUM- 1+/CD138+细胞，诊断为CE。
排除标准为:
1) 在1周内使用抗生素和/或益生菌制剂(局部或全身);
2) 采集样本前1周内有性行为;
3) 取样前1个月内阴道冲洗;
4) 最近6个月内使用过宫内节育器;
5) 吸烟和/或饮酒。除诊断为CE外，非CE组具有相同的纳入和排除标准。
注：所有受试者均获得书面同意，并经武汉大学人民医院伦理委员会批准(批准通知号:WDRY2023- K090)。
◆ 研究过程该研究的设计和流程图如图所示：
在本研究中，所有样本均在子宫内膜活检前采集。用无菌生理盐水擦拭外阴。随后，使用无润滑剂的一次性无菌阴道窥镜完全暴露宫颈。使用两个无菌拭子从后穹窿收集阴道分泌物：一个使用Nugent评分法进行评估，另一个储存在−80°C下用于后续16S rRNA基因测序分析。
项目采用杭州谷禾核酸提取试剂盒(GHFDE100)提取阴道冲洗液样本的基因组DNA。用引物515F(5'- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3')和806R(5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3')扩增16S rRNA的V4区。为了实现多重测序，将样品特异性对端6bp条形码集成到TrueSeq适配器中。纯化和定量后，整个DNA池在Illumina NovaSeq6000平台(Illumina)上按照协议进行测序。
使用Vsearch v2.22.1组装拼接双端序列，并以100%的相似性阈值将序列聚类为相同的扩增子序列变体(amplicon sequence variant, ASV)。利用QIIME2加权分类器获得ASV的分类信息。基于R包“VennDiagram”生成维恩图来说明分组间共有的和独有的ASV。
α-多样性是指群落内的物种多样性，以物种丰富度和归一化香农熵(均匀度)为其显著组成部分。物种丰富度采用Chao1指数进行量化，而Shannon多样性指数同时评估丰富度和均匀度。通过主坐标分析（PCoA）可视化两个组之间样本的微生物菌落结构。使用R的vegan包进行相似性分析（ANOSIM）评估微生物群落的差异。
此外，为了预测微生物的代谢功能，使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库与PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)进行代谢途径富集分析。组间的统计差异使用Kruskal-Wallis检验和Wilcoxon秩和检验进行评估，显著性水平定义为P < 0.05。
为了评估阴道微生物群组成对慢性子宫内膜炎(CE)的诊断潜力，应用随机森林算法，这是一种稳健的监督学习算法。使用R的pROC软件包生成的受试者工作特征(ROC)曲线评估模型的整体性能。曲线下的面积（AUC）量化了ROC曲线的判别能力。此外，还计算模型的特异性、敏感性和准确性。
连续变量的临床特征差异使用Student's t检验进行评估，而分类变量则需要使用χ²检验或Fisher精确检验进行评估。统计分析使用SPSS版本27（IBM）进行，P < 0.05被认为具有统计学意义。
研 究 结 果在98名参与者中，49名被诊断为CE，其标准是在30个随机选择的高倍视野中至少有一个视野中观察到超过5个MUM-1+/CD138+细胞。基线特征包括年龄、体重指数、抗穆勒激素水平和流产史，在两组之间显示了可比性(见表1)。
等级丰度曲线体现了物种丰富度和均匀度
等级丰度曲线描述了两组微生物群落的物种丰富度和均匀度。曲线范围越宽表明物种丰度越高，曲线越光滑表明物种分布越均匀。
从曲线上看，CE组的物种丰富度和均匀度高于非CE组(图2a)。维恩图显示，两组共有1180个ASV中的664个，其中CE组特有的ASV为354个(图2b)。利用Chao1丰富度估计器和Shannon多样性指数量化的α-多样性结果显示，两组间差异不显著(Chao1的P = 0.1733, Shannon的P = 0.9043，图2c,d)。
为了说明样品之间的微生物组分布空间，进行了PCoA，如图2e所示。结果显示，两组样本的分布是对称的。
值得注意的是，ANOSIM结果显示组间差异大于组内差异，尽管没有达到统计学意义(R = 0.022, P = 0.085)(图2f)。
阴道微生物群的细菌多样性
(a)用秩丰度曲线评价细菌的相对均匀度;
(b)显示组间重叠的维恩图;
(c)采用Chao1指数；
(d)Simpson指数估算口腔微生物多样性；
(e)使用Bray-Curtis通过主坐标分析计算β多样性；
(f)通过相似性分析计算了组间微生物群落的差异。
阴道微生物群的组成
文中分析了与CE相关的阴道微生物组的分类组成和变化。门、科和属水平的平均细菌群落组成如图3a-c所示。值得注意的是，与非CE组相比，CE组有10个属的细菌显著富集，包括双歧杆菌、普雷沃氏菌和加德纳菌(均P < 0.05)(图3d)。
慢性子宫内膜炎患者阴道微生物群落的系统发育概况
门(a)、科(b)、属(c)水平上细菌群落的平均组成。CE组与非CE组间差异有统计学意义(均 P < 0.05)。0.01 <矫正 P ≤ 0.05 ，标记为*。
代谢途径
通过KEGG途径富集的功能分析揭示了CE组中几种上调的途径，如图4所示。具体而言，参与多糖生物合成和代谢的途径（包括鞘糖脂生物合成、糖胺聚糖降解和其他多糖降解过程）上调。
此外，萜类和聚酮类代谢、II型聚酮类生物合成、鞘脂质代谢、次生代谢物生物合成、链霉素生物合成、外源生物降解、氯烷烃和氯烯烃降解以及凋亡相关途径也上调。总共有8个KEGG模块在CE组显著富集，重点是代谢相关途径(均P < 0.05)。
KEGG代谢通路的丰度差异
0.01< 校正P≤0.05，标记为*;0.001 <校正P≤0.01，标记为**。CE，慢性子宫内膜炎。
为测试阴道微生物组对慢性子宫内膜炎(CE)的诊断潜力，这里构建了一个随机森林分类器模型，用以区分CE样本和非CE样本。训练集用于模型训练，测试集用于评估模型性能。通过在发现阶段重复五次的10倍交叉验证，我们识别出四个最优标记 ASV 作为CE的标记集（图5a）。
这些选定ASV的对应细菌属包括：
肠杆菌属(Enterobacter)（ASV_49）
普氏菌属(Prevotella)（ASV_169）
粪杆菌属(Faecalibacterium)（ASV_265）
考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)（ASV_90）
随机森林模型在训练集队列上的AUC值为85.68%(95%置信区间[CI]， 75.62%-95.73%)，在测试集队列上的AUC值为83.26% (95% CI, 68.67%-97.85%)(图5b)。模型的特异性为82.76%，灵敏度为79.49%，准确率为80.88%。
这些发现表明，基于阴道微生物ASV标记的随机森林模型在区分CE和非CE队列方面表现出强大的诊断潜力。
图5.通过随机森林模型鉴定用于临床诊断的微生物标志物。
(a)使用阴道样品中四种选定生物标志物的概况，来自随机森林模型的变量的平均降低准确度。
(b)接收器工作特征曲线基于组织样本的训练集和测试集。ASV，扩增子序列变体; AUC，曲线下面积。
研 究 讨 论◆阴道菌群的变化可引起宫腔的菌群失调
女性阴道中的微生物组是一个完整的连续体观点已被广泛接受。阴道细菌可以异位定植并改变上生殖道中的微生物组。局部微生物组的生态失调会导致微环境发生复杂的病理生理变化，最终扰乱与免疫反应、炎症和凋亡相关的各种过程，从而促进病理状况。
阴道和宫腔内的菌群变化有一定的同步性，阴道菌群的变化可引起宫腔内的菌群失调，从而影响女性生殖健康。
本研究旨在对有或没有慢性子宫内膜炎(CE)的女性阴道微生物组的群落结构和功能进行初步探索。此外，文章中还提出了基于阴道微生物ASV的新型非侵入性CE诊断标志物。
◆特定的菌群可作为新型非侵入性CE诊断标志物
与先前的研究结果一致，该研究中没有发现慢性子宫内膜炎组和非慢性子宫内膜炎组阴道微生物组之间的α-多样性或β-多样性有显著差异。
值得注意的是，微生物组的低组内变异情况表明其作为潜在诊断标记具有一定的稳健性。与非CE组相比，慢性子宫内膜炎组中几个低丰度属的富集程度不同，包括双歧杆菌，普雷沃氏菌和加德纳菌。
双歧杆菌
双歧杆菌以其保护作用而闻名，其高丰度在CE组中令人惊讶。双歧杆菌菌株作为益生菌用于肠道炎症、严重疾病和抑郁症患者的肠道微生物组调节已有很长的历史。然而，其他研究报告称，在一些不健康的情况下，包括子宫内膜异位症、高危人乳头瘤病毒和不孕症，阴道中双歧杆菌含量很高。这种不一致的潜在机制尚不清楚，需要进一步研究。
加德纳菌和普氏菌
加德纳菌和普氏菌是公认的阴道生态失调的指标。这些属的定植改变了免疫系统，并诱导了促炎反应。在宿主-微生物共培养模型中，加德纳菌与宫颈阴道屏障的破坏有关，同时促进小鼠中普雷沃菌属对上生殖道的侵入性感染。
总的来说，该研究结果表明，两组之间的阴道微生物组发生了实质性变化，突显了阴道冲洗液样本作为检测慢性子宫内膜炎的诊断工具的潜力。
◆阴道菌群的变化可引起宫腔的菌群失调
KEGG途径富集分析强调了关键代谢过程的上调，特别是CE组的聚糖生物合成和代谢。覆盖阴道上皮细胞的聚糖涂层是保护屏障的重要组成部分。乳杆菌与阴道上皮的粘附被认为是具有竞争性地抑制病原体，而上皮的糖胺聚糖在这些过程中起着至关重要的作用。
值得注意的是，糖胺聚糖的消耗与宫颈上皮细胞屏障功能的破坏有关，这可能会增加对局部细菌和上升感染的易感性。这表明CE患者的微生物组失调可能会对微生物侵入阴道的主要门户产生负面影响，并引发宫内炎症。
总结关于慢性子宫内膜炎(CE)的标准化定义和诊断指南仍存在争议，最被接受的诊断依赖于子宫内膜活检。基于选定的阴道微生物群构建了CE诊断模型。本文研究中，引入了一种新的随机森林模型，该模型可以根据ASV以更高的灵敏度和准确性将CE患者与使用阴道分泌物的健康个体区分开来。该研究结果表明，阴道微生物组的变化可以作为诊断CE的指标，为慢性子宫内膜炎提供了一种更容易获得和更方便患者的诊断选择。
然而，该研究也存在一定的局限性。首先，它主要侧重于检查有慢性子宫内膜炎和没有慢性子宫内膜炎的女性之间的成分差异，而不是研究与慢性炎症相关的免疫失调的潜在机制。其次，阴道微生物样本是在分泌中期收集的，这可能无法解释整个月经周期中微生物群组成的变化。第三，作为一项单中心调查，发现的普遍性可能有限。考虑到饮食和运动等因素，多中心方法可以提供更全面的解读。
最后，多种组学方法的整合（包括培养组学、元转录组学和代谢组学），可以提供对微生物群落功能的全面了解。这种更广泛的视角对于阐明阴道微生态系统内复杂的网络和阴道微环境的潜在变化至关重要。
阴道微生物生态失调是慢性子宫内膜炎的重要指标。该研究确定了与慢性子宫内膜炎发展相关的潜在候选细菌，并提出了潜在的机制。基于阴道微生物群的生物标志物有望成为检测慢性子宫内膜炎的非侵入性工具。需要进一步的研究来发现特定阴道微生物组在慢性子宫内膜炎中的功能，并确定具有诊断能力的强大阴道微生物标记物，以区分患有慢性子宫内膜炎的个体。
本文转自：谷禾健康
https://blog.sciencenet.cn/blog-2040048-1455185.html
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