独特的代谢生态位使菌株能够植入肠道菌群

谷禾健康  原创

菌株的定植一直是一个重要问题，无论是婴幼儿的早期定植还是希望通过菌群干预改变菌群构成或益生菌补充的方式实现益生菌的定植。但是受原有菌群互作和环境影响，如何提高菌株定殖效率和改善定向增殖效果存在很大困难。通过独特的营养代谢特征使用稀有营养系统可实现控制菌种移植，并且不受原菌群结构影响。通过改造菌株，可以精准的通过营养系统来实现有效可控的定制对基于菌群的生物疗法具有重要意义。

来自斯坦福大学医学院微生物学与免疫学系和 Novome Biotechnologies 公司的研究人员在 一项研究中指出，独特的代谢生态位能使菌株植入肠道菌群，相关研究成果发表在Nature期刊。

通过控制海洋多糖、卟啉和一种含有用于卟啉利用的罕见基因簇的外源性拟杆菌菌株来产生独有的代谢生态位。对外源性菌株给予专有的营养，使得外源性菌株在具有不同肠道微生物群落的小鼠中以可预测的丰度有效的植入，这种针对性的饮食支持足以克服同基因菌株的优先排斥，并使菌株替换成为可能。

他们演示了将 60 kb 的卟啉利用位点转移到幼稚的类杆菌菌株中，并通过改变卟啉的剂量，对肠道内的应变丰度进行多个数量级的精细调控。最后证明了这个系统能够将一个新的菌株引入结肠隐窝生态系统。这些数据强调了营养有效性对形成微生物区群成员的影响，扩大了在复杂微生物群背景下进行广泛研究的能力，并对肠道中基于细胞的治疗策略有意义。

Niche ( 生态位 )：是指一个种群在生态系统中，在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的功能关系与作用。生态位又称生态龛。表示生态系统中每种生物生存所必需的生境最小阈值。

Bacteroides ovatus（卵拟杆菌）：能够利用膳食果聚糖和海洋多糖(marine polysaccharide)

GFP ( 绿色萤光蛋白 )：在细胞生物学与分子生物学中，绿色萤光蛋白(GFP)基因常用做报告基因 (reporter gene)。绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子)上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术，绿色萤光蛋白 (GFP) 基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色萤光蛋白 (GFP) 基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼（例如斑马鱼），植物，苍蝇，甚至人等哺乳动物的细胞。

Priority Effects ( 优先效应 )：在信息呈现顺序中，首先呈现的信息比后来呈现的信息在印象形成中有更大的权重

研究背景

高度竞争和动态的肠道微生物群的微生物组成的变化可以影响宿主生物学的许多方面。尽管肠道微生物组成对人类健康很重要，但控制共生菌株入侵现有复杂群落的规则还没有得到很好的解释。常驻菌株往往排除了与其类似的入侵菌株，在某些情况下，被现有菌株占据的生态位可以被类似的入侵菌株利用。无法预测或控制粪便微生物移植的结果表明，需要对影响新菌株是否能够整合到预先存在的复杂微生物群的因素进行基本了解。

饮食是形成社区成员和功能的主要力量。拟杆菌属的成员通过其多糖利用位点 (PULs) 编码的机制，大量利用饮食来源的微生物可获得的碳水化合物 (MACs)。假设特定的 MACs 可以作为一种杠杆，通过它可以调节不同的社区中定植菌株密度。

拟杆菌种具有有趣的定殖行为，其中早期定殖者将排除具有挑战性的同源菌株，这种现象被称为优先效应。假设这种行为可以通过向具有挑战性的菌株提供特殊营养来克服，从而创造一个独一无二的代谢生态位。

罕见拟杆菌属菌株对卟啉的消耗是通过水平转移的 PUL 实现的，PUL 来源于海洋细菌。

方法

菌株：

废水处理设施的主要废水中分离出来的 NB001（利用卟啉的B.ovatus）和 NB004 (原始的B.stercoris)

细菌培养和菌株分离：

所有细菌的生长都是在37°C的厌氧条件下进行的，在富培养基(胰蛋白胨-酵母-葡萄糖12)中进行生长，不添加抗生素。

所有细菌的生长都是在 37°C的厌氧条件下进行的，在富培养基(胰蛋白胨-酵母-葡萄糖12)中进行生长，不添加抗生素。使用过滤器消毒）中生长 24 小时，在1：200的新鲜培养基中继代培养并生长 24 小时，并在 BHI-BA 上连续稀释。将单个菌落挑选到 SMM 中进行生长确认、低温储存和下游分析。

全基因组测序与分析：

使用 PureLink 基因组 DNA 迷你试剂盒 (Invitgen) 从 NB001 和 NB004 中提取基因组 DNA。基于 Geneious 进行基因注释和比对，NB001 的全基因组测序显示了一个与先前描述的卟啉 PUL 高度同源的基因簇。

卟啉PUL转移和基因敲除 ：

使用质粒 pWD034 敲除了预测对海藻 MACs 生长至关重要的8个基因。

基于基因注释和赋予 PUL 能力的移动元件的序列比对，设计了三个不同大小的最小PULs（20kb，40kb和60kb）。获得具有短长度和中等长度 PUL 的 B.thetaiotaomicron

通过敲除卟啉利用基因，验证了完整的 PUL 对卟啉体外特异性生长的要求

小鼠实验：

无菌小鼠 (Germ-free) 或限制性植物 (RF) 8-16 周的常规雄性或雌性小鼠被安置在隔离器中。选择大小足以产生统计显著性的样本，在断奶时将动物分组。通过口服 108 c.f.u将所有拟杆菌属菌株接种到无菌或RF小鼠中，用健康人类供体的粪便样本将小鼠人性化 (Hum-1、Hum-2)。在 NB001 导入前一周，小鼠被喂养缺乏 MAC 的食物。NB001 导入7天后，小鼠切换到定制饮食，菊粉或海藻作为唯一可用的 MAC。RF小鼠在水中以指定的百分比给予卟啉。

16S rRNA 分析DNA

从粪便样品中提取 16S rRNA 分析 DNA，并在 16S v4 区域( 515F，806R )进行扩增。使用Qiime1.9 来分析所得到的 Illumina 产生的测序读数。数据被分类到具有最低读数 ( 16384 )的样品，并且通过 UCLUST 和通过 Greengenes13.8 数据库的分类分配执行OTU注释。

主要结果

生态位有效性因微生物群而异，可通过添加可以通过添加一种特殊营养物质来调节。 

（privileged nutrient）

a 图 实验设计方案将具有三种不同肠道菌群的小鼠（rf）或人类（hum-1，hum-2）定植NB001。NB001在粪便中被追踪7天，小鼠被切换到含有菊粉（in.）或富含卟啉海藻的特殊多糖周。

b 图 为未添加特殊营养物质时定植菌株（NB001）在粪便中的密度。

c 图 为添加富含菊粉（in.）营养物质时定植菌株（NB001）在粪便中的密度。

d 图 为添加富含卟啉（por.）营养物质时定植菌株（NB001）在粪便中的密度。

cd图 中通过颜色阴影区分在饮食中添加特殊营养物质之前和之后粪便中NB001的密度。

通过KruskalWallis检验查看组间差异显著结果，“*”表示有显著差异，“n.s.”表示无显著差异。灰色阴影框表示检测的限度。

获得特殊营养素可以调节种群大小并克服NB001(PUL+)同基因菌株的优先排斥

Total（可培养厌氧菌总数）

ab 图，被NB001(PUL+)菌株定植的常规小鼠与缺乏MAC食物喂养或富含MAC食物喂养的常规小鼠，在同样给予卟啉后，菌株丰度发生了变化。绿色阴影为给予卟啉的时间周期。

c 图，被NB001(PUL-)菌株定植的常规小鼠与富含MAC食物喂养的常规小鼠在给予卟啉后，菌株丰度没有变化。

d-f 图，常规小鼠进食富含MAC的饮食后，用PUL定植6天，第6天用PUL+进行挑战。

d 图，在没有给予卟啉的情况下，挑战菌株（PUL+）被现有菌株（PUL-）排除了。

e 图，在给予卟啉的第8天，挑战菌株（PUL+）取代了现有菌株（PUL-）。

f 图，挑战菌株（PUL+）与现有菌株（PUL-）在连续3天的卟啉脉冲后稳定共存。

对种群大小的控制是可以设计的，并且具有高度的可调性 

c 图，将含有中等长度 PUL 的 B.thetaiotaomicron 菌株在常规小鼠中定植，喂养富含 MAC的食物和添加了1%卟啉的饮用水，展示了添加卟啉前后的菌株丰度变化

d 图，将含有中等长度 PUL 的 B.thetaiotaomicron 菌株在常规小鼠中定植，喂养富含MAC的食物和添加了1%卟啉、0.1%卟啉或0.01%卟啉的饮用水，表现出对卟啉的精细调节（绿色阴影部分）可以影响菌株的丰度。

e 图，图像为宿主的近端结肠，表达GFP标记的NB001菌株在常规小鼠中定植，给予0.01%的卟啉(左)或1%的卟啉(右)

对卟啉的使用使结肠隐窝定殖成为可能 

将表达 RFP 标记（红色）的野生型 B.thetotaomicron 引入无菌小鼠体内，7天后再引入表达GFP 标记（绿色）的含有中等长度 PUL 的工程化 B.thetotaomicron 挑战菌株。

a 图 表示在没有给予卟啉的情况下，挑战菌株被从结肠隐窝群体中剔除了。

b 图 表示，当重新给予卟啉时，可以重塑结肠隐窝群体。

c 图 表示在有或没有卟啉的饮食中结肠隐窝中细菌的定量(每组3只小鼠，每只小鼠统计100个隐窝细菌)。双侧t检验，p=0.0395(*)。误差条表示标准差。

总结

利用全基因组测序注释结果改造菌株中的基因，使用小鼠进行动物实验，结合16S rRNA测序监测不同专有营养的给予对定植菌株丰度的影响。对数据使用 KruskalWallis 进行差异检验。研究了一种使用稀有营养系统对控制菌种移植的有效途径，不依赖于背景菌群，并将给予专有营养作为菌种融入肠道群落的关键调控因子。

谷禾健康是谷禾面向健康领域的品牌，通过无创采集微量粪便样品，常温快递运输至谷禾检测中心，经全自动化样品处理和提取后大规模高通量测序获取菌群基因数据并进行分析解读，凭借全球领先的样本积累和业界独有的人工智能算法实现了基于肠道菌群的疾病预测和系统健康风险评估, 以及肠道菌群，病原物感染，重金属污染以及营养物质和激素代谢水平等在内的综合健康风险提示，并提供精准个性化的健康管理方案。公司成立于2012年，总部位于杭州，拥有优秀的研发团队和独立实验室，经过多年的积累，已完成近6万例临床肠道菌群样本检测，并构建了超过20万各类人群样本数据库。谷禾健康-让您和您的家人更健康。