Improving the Editing Efficiency of CRISPR-Cas9 by Reducing the Generation of Escapers Based on the Surviving Mechanism

基于存活机制，通过减少逃逸者的产生来提高CRISPR-Cas9的编辑效率

来源：ACS SYNTHETIC BIOLOGY

IF：5.249

摘要：由于针对DNA的高特异性和高度便利的可编程性，应用于消除微生物组中特定菌株（如抗生素耐药菌）的基于CRISPR-Cas的抗菌剂被逐渐开发出来。然而，逃逸者的产生使得消除效率远远低于美国国立卫生研究院推荐的可接受率（10（-8））。在此，我们进行了一项系统的研究，深入了解了大肠杆菌的逃逸机制，并相应设计了减少逃逸者的策略。我们首先表明，在以前建立的pEcCas/pEcgRNA编辑下，大肠杆菌MG1655的逃逸率为10(-5)-10(-3)。对大肠杆菌MG1655中ligA位点获得的逃逸者的详细分析发现，cas9的中断是产生存活者的主要原因，特别是IS5的频繁插入。因此，接下来的sgRNA被设计为针对 "肇事者 "IS5，随后杀伤效率提高了4倍。此外，在无IS的大肠杆菌MDS42中的逃逸率也在ligA位点进行了测试，与MG1655相比，类似于减少了10倍，但在所有幸存者中仍然观察到cas9的破坏，表现为帧转移或点突变的形式。因此，我们通过增加cas9的拷贝数来优化工具本身，以保留一些仍具有正确DNA序列的cas9。幸运的是，在16个测试基因中，有9个基因的逃逸率降到了10（-8）以下。此外，加入lambda-Red重组系统生成pEcCas-2.0，在MG1655的基因cadA、maeB和gntT上实现了100%的基因删除效率，而之前这些基因的编辑效率很低。最后，再将pEcCas-2.0的应用扩展到大肠杆菌B株BL21（DE3）和W株ATCC9637。该研究揭示了大肠杆菌在Cas9介导的死亡中存活的机制，并根据该机制建立了一个高效的编辑工具，这将加速CRISPR-Cas的进一步应用。