Statistical Analysis of the Benefits of Focused Saturation Mutagenesis in Directed Evolution Based on Reduced Amino Acid Alphakets

基于生物传感器的高通量微滴筛选法改进合成D-阿洛酮糖的差向异构酶

来源：ACS CATALYSIS

IF：13.7

摘要：立体、回归和化学选择性酶的定向进化，丰富了合成有机化学的工具箱。在不同的基因突变技术中，在酶的结合口袋部位进行饱和诱变（SM）已成为控制选择性和活性的一种可行的方法。传统上，使用编码20个氨基酸的NNK密码子，但随着随机化位点的大小超过一个残基，为确保大于等于95%的库覆盖率所需的转化体的超量取样迅速达到大量，不可能以人为方式进行筛选。因此，许多研究小组满足于只筛选所设计的蛋白质序列空间的一小部分，但这意味着最好的突变体将被错过。另外，有研究表明，使用高度缩减的氨基酸字母表可以产生小而精的库，需要较少的筛选。在此，我们讨论了哪种方法更有效的问题。两种不同类型的酶作为立体选择反应的模型系统，即柠檬烯环氧化物水解酶和P450-BM3。对不同大小的SM库筛选了同等数量的转化体，这些库是用NNK密码子退化和其他只对应一个或几个氨基酸的密码子构建的。转换率作为活性的粗略指示被用作初筛的参数，然后是基于GC的ee-determination。统计分析清楚地表明，选择合理设计的还原氨基酸字母表更有效，因为这种方法导致活性突变体的频率明显提高，立体选择性也明显提高。