结合正交CRISPR和CRISPRi系统进行大肠杆菌基因组工程和代谢通路调控

Combining orthogonal CRISPR and CRISPRisystems for genome engineering and metabolic pathway modulation in Escherichia coli

IF:4.002

来源：Biotechnology and Bioengineering

摘要：

利用化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes, SpCas9)的CRISPR (CRISPR interference, CRISPRi)和利用催化弱化SpCas9 (SpdCas9)的CRISPR干扰(CRISPRi)在大肠杆菌工程中得到了广泛应用。为了利用CRISPR整合基于SpdCas9的CRISPRi模块，同时避免SpCas9/SpdCas9与其同源单链导向RNA (sgRNA)之间的相互干扰，本研究旨在探索一种与SpCas9正交的备用Cas核酸酶。我们比较了几种不同微生物的Cas9变种，如金黄色葡萄球菌(SaCas9)和嗜热链球菌CRISPR1 (St1Cas9)，以及来自新弗朗西斯菌(Francisella novicida)的Cas12a (FnCas12a)。在常用的大肠杆菌模型基因LacZ中，我们发现SaCas9和St1Cas9比FnCas12a更能诱导DNA裂解。St1Cas9和SaCas9均与SpCas9正交，诱导的DNA剪切促进了10 kb大小的外源DNA的整合，St1Cas9在重组频率/准确率上优于SaCas9。我们利用St1Cas9系统整合SpdCas9和sgRNA阵列，在不影响CRISPRi敲除效率的情况下，敲除pyc和adhE三个基因。结合正交CRISPR/CRISPRi进行代谢工程，可以促进丁二酸的产生，同时抑制副产物的形成，为大肠杆菌的工程开辟了一条新的途径。