近期有个朋友得知二代高通量测序有挽救危重病男孩生命的情况，想了解一下具体是怎样的一个过程，因为他的小孩出生就患有面部血管瘤，在想是否这个技术也可救治他小孩的这个疾病。我们确实也非常理解面对疾病的人们的心情，我们是真心希望高通量测序技术能够造福于更多有需要的人士，所以我们也非常希望能够运用通俗易懂的语言来传达我们所了解的最新研究成果，希望这些声音能够被有所需要的人士捕获感知而有所帮助。现在我们解析一下前不久发表在2014年6月19日The New England Journal of Medicine(NEJM)上的一篇文章Actionable Diagnosis of Neuroleptospirosis by Next-Generation Sequencing：

       在2013年4月，这个14岁的男孩出现头疼、发热等症状，高烧39.4℃持续了6天，在经历两次半相合骨髓移植手术后，因腺苷脱氨酶缺乏症和部分免疫重建导致重症联合免疫缺陷病，三次到医疗机构住院超四个多月，伴随发烧和头痛的症状，威斯康星大学的医生给他施用了糖皮质激素—通常用于自身免疫性脑炎的一种有效疗法，但是男孩的病情却恶化了，出现严重的脑积水和无法控制的癫痫发作，只能够在药物辅助作用下昏迷后才平息下来。以下是针对这个14岁患有症重脑膜炎男孩的临床治疗过程：

       A图中显示是从该患者在2012年8月去波多黎各旅游的时候开始记录的，在2013年10月开始康复记录截止。其在患病过程中所发生的重大事件已用黑色箭头标出。

       B图中显示的是患者在第三次住院期间接收医院治疗获得相关实验数据。上表中红色的曲线表述患者体温；紫色的直线表示患者外周血白细胞数目；下图中表示的是在患者连续收集的脑脊液样本中测得的关于白细胞数目变化（柱形表示）及其不同类型的白细胞所占据的比例（深蓝色是中性粒细胞、浅蓝色是淋巴细胞、绿色是其他类型白细胞）、血糖变化（黑色虚线）以及蛋白含量（黑色实线）的变化过程；横向的灰色线表示药物治疗；*星号表示给病人结合头孢呋辛进行治疗，这个治疗对患者临床症状并没有得到改善。

      上图中所施用治疗中名字缩写代表的含义为：MEP为6-甲氢化泼尼松、CFX表示头孢呋辛、CFPM表示头孢吡肟、EVD表示脑外引流、MRI表示核磁共振成像、PCN G表示青霉素G、PEG-ADA表示聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶、VANC表示万古霉素。

       基因组测序方案设计：

       取材：患者的脑脊液（CSF）样本；患者的血液样本；一个不相关的病人的血液作为阴性对照；

       样本处理：大约750 μl的脑脊液样本，分为两半；一半在DNA提取之前用DNase进行处理以最大限度地获得病毒DNA；一般脑脊液样本不处理直接进行DNA提取；

       测序：共4个样本，结合illumina MiSeq平台进行测序，共获得10,196,620 raw reads；

       数据产出：

             不相关病人血样DNA测序数据产出：2,008,883 reads；              

             患者的血样DNA、未处理过的CSF样本和DNase处理过的CSF样本共获得8,187,737 reads；

      数据分析：是结合上述测序数据经SURPI（Sequence-based ultra-rapid pathogen identification，详见nature methods文献）分析流程来快速鉴定病原基因组序列的方法进行分析的。

      上图就是结合二代高通量测序（NGS）诊断钩端螺旋体感染的分析流程。图A是指运用NGS诊断病原体的时间轴。NGS数据信息分析的时间，其中饼图绘制、注释插入花了97mins，仅占完成所有分析时间48小时的3.4%。SURPI是快速鉴定病原基因组序列的方法。为获得更长的连续的序列信息，在denovo拼接过程中有重叠区域的序列均拼接在一起。图B中表示的是最终获得475条拼接序列和参考数据库中钩端螺旋体Leptospira borgpetersenii 基因组最为匹配。图C中列出了在患者的脑脊液中检测到的细菌和病毒，包括丙酸杆菌、anello病毒和噬菌体，这些都是通常都被鉴定为具有致病性的。图D中列出的是rpoB全长基因序列和在患者脑脊液中鉴定的能够引起爆发性脑膜炎的钩端螺旋体菌种进行系统进化分析所鉴定的种属关系，将该钩端螺旋体命名为Leptospira santarosai strain UW（UW即指University of Wisconsin威斯康星大学）。

       结论：在脑脊髓液中而非外周血中鉴定获得病原体钩端螺旋体Leptospira santarosai strain UW，不能采用治疗自身免疫性脑炎的糖皮质激素进行治疗，而需静脉大剂量注射青霉素G（130万单位/天），患者在接受注射青霉素G7天后身体慢慢开始康复，14天后就出院了。

      文献链接：Actionable Diagnosis of Neuroleptospirosis by Next-Generation Sequencing.pdf，如不能下载文献请与我联系ttwu@macrogencn.com，谢谢！

       新浪博客：http://blog.sina.com.cn/s/blog_13366249a0102uxd1.html；

      生物通报道：NEJM—新一代测序技术挽救危重病男孩。