脑科学实验的艰难经历

     王庆浩 

1.   脑科学研究的难点

随着科学的发展，人类对大到天体，小到原子已经有了一定的了解，但对我们自己天天利用的大脑却知之甚少。我们每天早晨一觉醒来，就要动脑了：是再躺一会，还是立即穿衣起床？起床之后又要动脑了：是先锻炼一会儿，还是立即做饭？一天之内，我们需要不断动脑，不断思维，不断做出各种各样的决定。我们的大脑无时不在转动，然而我们对大脑运转的秘密却一无所知。大脑如何做出决定？思维机理是什么？意识是什么？智慧何在？喜怒哀乐的机理是什么？等等诸多疑问，至今仍然没有答案，仍然困扰着人类。脑科学是人类科学研究需要攻克的最后堡垒。

脑科学研究的难点何在？ 让我们回顾一下脑科学研究历史可能会受到启发。脑科学研究成功的案例不多，但依赖人类的聪明才智和坚忍不拔的努力，还是有几个科学家在脑科学上作出了出类拔萃的贡献。回顾总结他们的成功或许为我们以后的研究提供一些线索。

十九世纪末，俄国科学家巴甫洛夫看到狗在没有吃到食物之前便开始流口水，于是通过刺激与食物关联来诱发狗唾液外分泌进行一连串的探索性实验。最终成功的揭示了条件反射。二十世纪中叶，美国科学家Roger W. Sperry通过裂脑人实验，成功的揭示了左右大脑功能的差异，提出了大脑不对称性的"左右脑分工理论"。

美国科学家埃里克·坎德尔的《追寻记忆的痕迹》生动的讲述了他自己如何发明一种方法来揭示大脑记忆的机理。二十世纪六十年代，坎德尔起初决定研究记忆机制，但哺乳动物的大脑太大神经细胞太多，很难检测记忆过程的基本结构和电生理的变化。通过大量分析，他决定应用海兔进行实验，海兔的神经系统仅有2万个神经细胞，多数细胞体积相当大。坎德尔应用海兔实验成功的揭示了记忆的机理。

二十世纪70年代，O’Keefe应用精细电极在大鼠海马中发现了位置神经细胞。90年代O’Keefe的学生莫索尔夫妇优化此技术而发现了网络细胞。

上述脑科学研究的历史表明，脑科学重大成果的取得都是找到了一个非常合适的切入点。脑科学研究的难点是找不到合适的切入点，不知道从何处下手进行研究。在其他科学方面一个新方法可以揭示许多自然秘密。而在脑科学研究之中，发明一个新方法只能揭示一个秘密，因此发明新的研究方法才是解决脑科学的关键。

在脑科学的研究史上，不乏失败之例。许多顶尖科学家为破译脑科学之谜殚精竭虑却收效甚微。最著名的是“分子生物学之父”克里克，从1966年开始进行意识研究一直到2004年去世，期间38年，也没有搞清楚意识究竟是什么。20世纪末，脑科学引起了政府的高度重视。1990年美国总统布什宣布：20世纪的最后十年为“脑的十年”并投入大量经费，然而十年过去了，却进展不大。1995年，日本政府启动“脑科学时代”计划，政府宣布投入200亿美元把“认识脑、保护脑、创造脑”作为脑研究三大目标。然而20年后，目标依然渺茫。2009年，欧盟脑计划的发起人瑞士神经科学家亨利·马克拉姆（Henry Markram）夸下海口：只要十年时间，他就可以用计算机模拟出一个功能细节完备的人类大脑。为此，2013年，欧盟大手笔挥给他13亿欧元(约合99亿元人民币)，并将这一“人类脑计划”项目立为“未来新兴技术旗舰项目”，该项目也成为全球最重要的脑计划项目之一。然而2019年到期了，该计划却破产了，该笔经费却打了水漂。

上述事实说明仅仅投入巨额经费巨大人力是不够的，也是徒劳无功！

  尽管破解大脑之谜困难重重充满艰辛，但人类不会对此望而生畏止步不前。明知山有虎偏向虎山行。人类对大脑的好奇心一点没有减弱，一批失败了，一批又冲上去。前赴后继，永不停息。

2.   美国得到的信息

我于2012年9月到美国康奈尔大学纽约医学院做访问学者，得知有二个学科处于研究前沿。一个是肿瘤，一个是脑科学。我对脑科学特别感兴趣，于是，阅读了大量脑科学研究的书籍和论文。

   3. Sperry的启发

一次阅读Roger Sperry论文 Optic nerve regeneration with return of vision in anurans（Sperry, R. W. (1944). J. Neurophysiol 7, 57-69）：切断蝌蚪视神经，并把眼球旋转180°。过一段时间，蝌蚪变成小蛙，新的视神经会重新长出与大脑连接，观察小蛙的视觉变化。这给了我一个很大的启发，使我突然想到，在动物卵子发育时期的大脑形成过程中，损毁部分脑细胞，等动物发育长大后，观察其行为变化，是否可以发现某些有关大脑的新现象？

4.   寻找合适的实验动物

2013年10月回国后开始了这个想法的实验。首先是寻找合适的实验动物：哪种动物的卵可以应用？查找资料的发现一些水生动物的卵是透明的，推测在显微镜下可以损毁其部分大脑。恰巧天津市有一个北方最大的普济河道花鸟鱼虫市场，专门出售各种各样的观赏鱼类。我一次购买三五种，带回家中养一养试一试哪种可用。先后试过斑马鱼、燕鱼、罗汉鱼、国斗鱼、蓝曼龙、六角恐龙、金蛙等30多种。2014年3月25日观察到金蛙产卵，但金蛙卵内全是黑的，什么也看不到。2014年5月6日观察到燕鱼卵透明，燕鱼很难养，容易死亡，而且燕鱼很少产卵。2014年8月28日观察到斑马鱼卵是透明的，但斑马鱼卵太小，脑部很难用玻璃针切割。2014年10月15日观察到金蛙卵在发育过程中头部是透明的，前脑、端脑、中脑、后脑非常清晰。当金蛙卵处于发眼期时，两眼之间距离很宽，大脑组织呈浅黄色，清晰可见。金蛙卵很大，发育后变得扁长了，大脑各部分可以用玻璃针切割，适合做脑细胞损毁实验。尽管金蛙卵不透明，但在发育过程中，大脑是透明的。又花费了半年才明白：不是卵透明，而是大脑透明才是最合适的实验动物。金蛙每次大概产卵300-900个，足以满足实验需要。产卵以春秋为多，但全年均可产卵。后来摸索出一点经验，改变水温：把水温由13°C增高到21-23°C，或者由21-23°C降低到13°C，可以促进产卵。经过1年的实验，终于找到了合适的实验动物金蛙，学名非洲爪蟾。

左图：金蛙抱对；右图：金蛙卵

从左到右：发育中的金蛙卵和显微镜

5.蝌蚪脑细胞损毁实验

找到合适的实验动物卵之后，就开始按照设想进行受精卵大脑发育过程的损毁实验了。但真做起来并不是很容易的。由于刚刚发育的大脑比针尖还小，在显微镜下用玻璃针切割并不是很容易的。手抖一下，位置就偏离了，总是做不准。但这不是很难，练习一段时间，手就不抖了，切割就比较准确，此时可以做蝌蚪大脑细胞损毁实验了，具体做法如下：

先用琼脂糖在小培养皿里制成凝胶，用后放在水中，可以反复应用。

2015年2月18日，蝌蚪端脑损毁实验：将凝胶放在显微镜下，用小吸管将tail-bud stage蝌蚪吸出放在凝胶上，玻璃针刺穿大脑，损毁蝌蚪的端脑，总数做了16个。19日观察结果：12个死亡，4个存活。之后又观察几天，存活蝌蚪端脑与正常蝌蚪形态一样，似乎恢复原样，行为没有任何变化，与实验设想完全相反，这是实验之前没有考虑到的。

从2015年2月到5月，做了大量的蝌蚪端脑、前脑、中脑和后脑损毁实验，大多数实验蝌蚪都会死亡，少数不死蝌蚪大脑形态与正常蝌蚪没有明显变化，行为也没有异常。

左图：刚出卵膜的蝌蚪；中图：玻璃针损毁大脑细胞；右图：玻璃针

左图：蝌蚪大脑；右图：荧光染色后蝌蚪大脑

6. 蝌蚪大脑异物填塞实验

把异物填塞进蝌蚪大脑不同部位会发生什么？为了解答这个问题，我在2015年6月到2016年底进行了一些列的实验。微米的颗粒很好制造，用锤子砸碎各种物体如玻璃、绿豆、木屑等，或者直接选用一些微细颗粒如细沙等，放在显微镜下除去大颗粒，选择微颗粒。但蝌蚪的大脑很小，是微米级的。要把微米的异物颗粒填进微米级的大脑可不是很容易的。微米的颗粒如何用镊子镊取？根本没有这么微小的镊子。经过反复思考，终于想到了一个方法：用玻璃针沾胶水沾取微粒。先用玻璃针刺破蝌蚪大脑，然后用带胶水的玻璃针沾取微粒放在刺破处，再用玻璃针将微粒导入蝌蚪大脑。用这种方法将铁微粒、砂微粒、木屑、纸屑、玻璃微粒，绿豆微粒等10多种异物放入蝌蚪大脑不同位置，观察结果与蝌蚪脑细胞损毁实验相同，除了大部分蝌蚪死亡之外，存活蝌蚪行为没有异常。

7. 蝌蚪大脑切割实验

做了很多蝌蚪脑细胞损毁实验和蝌蚪大脑异物填塞实验都没有取得预料的结果，或许切除蝌蚪的一部分大脑可以产生预料不到的结果，于是在2017年到2019年进行了蝌蚪大脑切割实验。

先把蝌蚪大脑划区，切除前部分1/4，再切除中间部分1/4，再切除后部分1/4，结果除了少数死亡外，大部分大脑形态没有变化，行为也没有异常。接着做了切除1/3,1/2，仍然没有异常。再做切除前脑、中脑和后脑实验，行为仍然没有明显异常。最后把整个大脑全切除了，蝌蚪仍然可以发育，仍然存活，但却出现明显异常，蝌蚪发育不完善，可以发育出脊髓，但没有头，没有内脏器官。但令人惊奇的是，这些无头蝌蚪仍然对刺激有反应，仍然可以游动，只能向前游动，不能后退，几天后当卵黄囊的营养耗尽之后就会死亡。蝌蚪没有头却对刺激有反应，却可以游动，这引起了我极大的好奇心，于是转向了断头动物的实验研究。

8. 断头蟋蟀实验

2020年我招了二个研究生，除了传统研究之外，安排她们做了断头蟋蟀实验。实验结果于2023年7月3日公布在著名生物预印本bioRxiv。在该论文中，我们发现无头蟋蟀展现智力，揭示了脑外智力新发现。这为脑科学研究增添了一种新方法。

该文章的题目是《Decapitated body intelligence (DBI) in cricket Gryllodes sigillatus》，中文译名《断头蟋蟀的智力》，链接如下：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.07.01.547349v1

为了研究无头蟋蟀的智力，我们使用去离子水、氯化钠、蔗糖和次氯酸钠来刺激断头蟋蟀的前腿，切断了胸部神经节的T1-T2神经连结。记录蟋蟀前腿的反应类型，计算和分析了反应时间、发生率和总反应次数。实验结果显示，断头的蟋蟀展现出四种类型的反应：腿的伸展、回缩、抬起和跳跃。反应时间和发生率因不同刺激溶液的类型和浓度而有所变化。同时，反应次数随着去离子水、氯化钠、蔗糖和次氯酸钠的增加而逐渐增加。进一步的损伤实验揭示T1胸部神经节能够控制刺激行为。结果显示：断头蟋蟀具备感知刺激并采取相应行动的能力。研究人员称之为无头蟋蟀智力（Decapitated body intelligence, DBI）或脑外智慧（Extrabrain intelligence, EI），这一发现表明智力不仅仅局限于大脑，还存在于昆虫的神经节中。这项研究解决了一个有趣的问题，即无头蟋蟀是否具有智力。这一研究主题具有高度的原创性，打破了智力仅局限于大脑的传统观念。

非常高兴的是我的这二个研究生已经顺利毕业，并找到了合适的工作单位。一个到当地的三甲医院，一个考取了北京军队文职。我们知道这种考试难度很大竞争激烈，但这个学生非常努力，竟然依靠毅力金榜题名。  

9. 断头动物研究或可破解一些大脑之谜

脑科学研究之难，难在“老虎吞天，无从下口”。我们所做断头蟋蟀实验证实，无头蟋蟀可以感受外界刺激做出相应行为。动物行为大致是：发现周围事物、经过思维，做出决定、采取行动。无头蟋蟀可以根据外界刺激做出反应这一事实提示我们：动物没有大脑也可以察觉周围事物，也可以思维、可也以做出决定，也可以采取合适措施，也可以做出合适的行动。这又提示我们：大脑的本质（意识、思维、决定、情感等等）可能不单在大脑，而大脑之外也存在。这又提示我们：可以利用断头动物来研究脑功能。

      脑科学研究需要新策略和新方法，将断头动物作为脑科学研究的模式动物无疑为脑科学研究增加了一个新策略和新方法。或许我们在研究复杂的有脑动物的同时，也应该把一部分注意力投入到断头动物的研究中，通过断头动物来理解大脑。应用断头动物作为模式生物来研究脑科学，或可揭开一些大脑的奥秘。