2020诺贝尔化学奖揭示的“不知道的不知道”

      在科学上，一些问题是已经得到解决而为人类所知的（Known knowns）, 一些问题是知道其存在但不知道其解决办法称为知道的不知道（known unknowns）, 而最为困难的问题是根本不知道这类问题存在称为不知道的不知道（unknown unknowns）。今年的贝尔化学奖就充满了这种奇妙的不知道的不知道和知道的不知道。

1. crispre初现，由不知道的不知道转化为知道的不知道

1987年,日本学者Yoshizumi Ishino小组在分析大肠杆菌iap基因及周边序列时偶然发现了一段位于3’端存在含有29个核苷酸高度同源重复序列,它们被含32个核苷酸的序列间隔开，这是crispre的出现。然而日本人发现的这个重复序列有什么生物学意义，当时没有人知道，只是将它作为一个有意思生物学现象发表了。以前人类根本不知道细菌基因组中存在一种crispre这种特殊的结构，通过Yoshizumi Ishino小组探索，把这种不知道的不知道转化为了知道的不知道。

                                      上面是最初发现的crispre重复序列

2. crispre复现，由不知道的不知道转化为更多的知道的不知道

   十多年之后的2000年，西班牙的微生物学家Francisco Mojica对嗜盐菌Haloferax mediterranei基因组序列进行分析时又发现这种有规律的重复序列，这引起了他的重视和进一步研究，结果显示这段序列在细菌和古细菌中广泛存在。由于Francisco Mojica的努力，这种结构变得更为人类所知了。2002年，荷兰学者Jansen等通过生物信息学分析发现了与crispre偶联蛋白Cas，人类由此又发现了一种不知道的不知道，将不知道的不知道转化为了知道的不知道。结构决定功能，这个重复结构到底有什么功能？2005年，Mojica等3个独立的小组通过生物学信息分析表明CRISPR的间隔序列spacer是外源DNA来源的，于是大家想到这可能对外来DNA具有免疫防御作用。2007年Horvath小组的Streptococcus thermophilus的实验证实了这一猜想。到此，人类将一种知道的不知道转化为了知道的知道。

3.crispre关联蛋白的发现

2008年，荷兰学者van der Oost小组发现CRISPR结构的转录本会被CasE蛋白切割成大量crRNA小分子，每个crRNA携带一个间隔序列RNA作为向导序列，指导Cas蛋白切割与其具有同源序列的噬菌体，因此推测CRISPR免疫的靶标分子是DNA。2010年，Moineau小组对嗜热链球菌Ⅱ型CRISPR系统进行研究，确定了该系统对外源质粒双链DNA上精确的切割位点，并且确认Cas9是介导靶序列切割所需的唯一蛋白。此时人类又发现一种不知道的不知道，将其转化为知道的不知道。

4. crispre/cas9基因编辑技术的形成

2011年，Charpentier对酿脓链球菌Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行了更加详细的深入的实验研究，他们发现在crRNA加工过程中一个关键的RNA组分反式激活crRNA（tracrRNA）。tracrRNA与crRNA序列匹配，可以在Cas9的帮助下招募RNaseⅢ对crRNA进行加工从而生成成熟的crRNA。他们的实验证实CRISPR核酸酶系统至少需要Cas9蛋白、成熟crRNA及tracrRNA。2012年，Charpentier和Doudna实验室合作，他们对该系统进行了简化，将tracrRNA与crRNA嵌合成一条单链向导sgRNA，只需sgRNA和Cas9蛋白两个组分即可靶向特定的序列，至此crispre/cas9这种高效简单的基因组编辑技术形成了。Charpentier和Doudna通过探索实验发现了原初的完整的生物学现象，提出了理论解释，揭秘了这种现象的机理，并利用这种生物学机理发明了一种崭新的基因编辑新技术。她们把不知道的不知道转化为知道的不知道，再转化为知道的知道。

5. crispre/cas9应用的扩展

2013年，张锋实验室和Church实验室几乎同时将该技术应用于真核生物的基因组编辑，这两篇文章开启了CRISPR/cas9编辑真核生物细胞的新时代。她们将知道的不知道进一步向前推进。

      大自然蕴藏了无数的奥秘，其中存在无数的不知道的不知道。科学研究的目的就是揭示大自然的奥秘，而这可能是钱学森之问：为什么中国总出不了大师的原因所在。我们不善于揭秘不知道的不知道，我们要克服我们的短板，有意识的增强这种探索能力。随着人类探索自然能力的增强，必然会把越来越多的不知道的不知道转化为知道的不知道，再转化为知道的知道。

There are known knowns. There are things we know that we know. There are known unknowns. That is to say, there are things that we now know we don't know. But there are also unknown unknowns. There are things we do not know we don't know.