作者：麦夕

        自上次推送抗条锈基因的克隆后，见链接。不知做抗病的小伙伴对BED-NLR的整合结构还有印象没？小编当时说要好好介绍一下目前植物抗病基因方面的研究进展。闲话少说，先抛出几篇曾较新看到的文章：分别题为"Defended to the Nines: 25 Years of Resistance Gene Cloning Identifies Nine Mechanisms for R Protein Function"、"What Do We Know About NOD-Like Receptors in Plant Immunity?"、"Molecular genetics and evolution of disease resistance in cereals"和"Dominant integration locus drives continuous diversification of plant immune receptors with exogenous domain fusions"。当然由于能力有限，可能还有其他较好的综述类文章，欢迎大家在留言区里推荐，我们一起共同学习。今天先讲一讲发表在The Plant Cell上的文章“Defended to the Nines: 25 Years of Resistance Gene Cloning Identifies Nine Mechanisms for R Protein Function”《不断完善的防卫：25年来抗病基因的克隆及其九种抗病机制的发现》。作者之一是国际国际著名分子植物病理学家、英国牛津大学教授Renier van der Hoorn。感兴趣的伙伴可以搜索一下他的文章，几乎每月都有进展，他们还有实验室主页http://www.plantchemetics.org/index.php。



自1992年第一个抗病基因-玉米的抗圆斑病（Helminthosporium carbonum）开始，截止2017年相继有314个抗病R基因被鉴定出来。见图1A。当然，这个数目是随时增长的。在这314个R基因中，有128个基因给出了可能的抗病机制。本文作者根据这些结果总结出当前存在九种抗病机制。见1B。说到抗病机制，就要提到经典的PTI（ 病原相关分子模式引起的免疫反应，基础防卫反应）和ETI（效应子激发的免疫反应）模型，这两种的主要区别是后者引发过敏性坏死反应（HR）。

图1A



但对于本文的分类，作者没有采取上面的依据，而是根据胞外和胞内两种对病原菌识别的机制划分，见图1B。因此，这九种抗病机制大体可分为：I）感知/响应和 II)丧失感病性。

对于感知/响应又可大致分为三种亚类型：Ia）类受体蛋白/激酶 (receptor-like proteins/kinases, RLPs/RLKs); Ib）类腺苷酸识别位点受体(Nod-likereceptors, NLRs); Ic）执行基因 (Executor genes)。对于前两种，RLPs/RLKs可直接/间接识别PAMPs (①和②), NLRs又分为直接/间接识别（③和④）以及整合的功能域（⑤ integrated domains, IDs)。另外⑥通过识别转录激活蛋白 (transcription activator-like, TAL) 能够引发下游防卫执行基因的表达。

对于丧失感病性也可大致分为三种亚类型：⑦主动丧失感病性（active loss of susceptibility）即通过加强表达免疫相关基因或者特异性降解/减弱病原菌毒素的酶；⑧被动丧失感病性 （passive loss of susceptibility）即“丢失 ”与病原菌互作的关键靶标基因；⑨ 通过寄主的“重新编程”（Reprogramming）减缓病原菌的生长。可参见图2。

图1B



图2



当作者把这些R基因按对应的物种分类后，发现除了第⑥类型外，其他机制都不是某一物种独有的或者专门针对某一病原菌的，见图1C。这些类型的抗病机制在植物王国里具有普遍性。但毕竟目前克隆到的R基因仍较少，所体现的分布不能反应出其自然的频率。

图1C



接下来对这九种抗病机制分别举例说明：



①细胞外直接感应  许多PAMPs都能够被RLPs和RLKs直接识别感应。这方面最经典的就是拟南芥类受体激酶RLK FLAGELLIN-SENSITIVE2 (FLS2)基因识别细菌的鞭毛蛋白flg22，flg22的肽链绑定FLS2后直接招来BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE (BAK1)的结合，这三者的晶体结构表明，flg22在其中扮演着分子胶体的作用来促进FLS2和BAK1复合体的形成。随着研究的深入，人们发现许多其他微生物的PAMPs都会发生与鞭毛蛋白类似的直接识别现象，这种直接感应的策略很普遍，有的会引起完全的免疫反应，有的会引起部分抗病反应。

②细胞外间接感应 这方面主要是在西红柿抗叶霉病中发现的。Cf-2是一个类受体蛋白RLP并对黄枝孢霉菌有抗性，能够识别黄枝孢霉的效应子Avr2和线虫的效应子GrVap1，但对于它们的识别需要一个中间介体Rcr3，Rcr3是一个编码类木瓜酵素的半胱氨酸蛋白酶 papain-like Cys protease。作者认为Rcr3更像是一个诱饵来诱使Cf-2对Avr2/GrVap1的识别，但Rcr3本身不是效应子，它的同源基因广泛存在西红柿、马铃薯和胡椒中；而Cf-2只存在于西红柿中，说明它更可能是后期进化产生的。

③细胞内直接识别效应子 直接识别效应子不仅发生在细胞表面，一些NLRs基因在细胞内也会直接与效应子作用，比如拟南芥的NLR RECOGNITION OF PERONOSPORA PARASITICA1 (RPP1)基因直接识别卵菌的效应子ARABIDOPSIS THALIANA RECOGNIZED1 (ATR1)；而在锈菌领域，必须要提到的就是亚麻锈的经典案例：亚麻锈无毒基因AvrL567能够直接被亚麻的抗病等位基因L5、L6和L7识别。这种方式最简单地解释了 “基因对基因”的互作，R和Avr蛋白直接结合并激发抗病反应。在亚麻锈最新的研究进展中，作者发现一个有趣的现象，NLRs受体在体内保持着结合ADP—ATP平衡状态，而一旦无毒蛋白侵入，就会打破这一平衡，且不同的等位基因由于其结合ATP能力的不同，导致最终产生的抗病反应程度也不同。关于这一块，小编抽时间好好讲讲。

④细胞内间接识别—诱捕和卫兵模式 许多NLRs基因与效应子的作用是通过酶的修饰或者寄主上的其他元件来实现的。这些额外的寄主蛋白被称为诱捕或卫兵，即他们是效应子的靶标或者模仿效应子的靶标。以西红柿抗病基因Prf为例，它能够与多个类受体细胞质激酶家族基因receptor-like cytoplasmic kinase (RLCK) XII family member作用，包括Pto和Fen。当Prf与Pto作用后会引起病原菌无毒蛋白AvrPto和AvrPtoB结合到Pto上，Prf识别pto-AvrPto的复合体或识别结合AvrPto后构象发生改变的Pto，从而激发下游的抗病反应。当卫兵蛋白不存在时，Avr蛋白与靶蛋白结合下调防卫反应，导致感病。靶蛋白结构的变化可能的机制为：Avr诱导靶蛋白发生磷酸化或水解靶蛋白。

⑤ NLR-IDs (integrated domains)NLR整合结构—受体上嵌入传感器 而这种抗病基因的整合结构近几年才人们提出，最早在拟南芥RRS1和水稻RGA5及Pik上发现。而在我们小麦里上期刚推出的抗条锈基因Yr5/YrSP和Yr7就是这种结构，对于整合的结构BED domain，它在抗条锈研究中是参与识别病原物的无毒基因的，至少在该区域碱基发生变化影响了抗病性。作者认为整合的这部分结构可以看做是一个类似传感器的作用，目前这块研究还比较少，今后可能会有更多的与此有关的基因被解析出来。

⑥执行基因—转录激活效应子的启动诱饵 在黄单胞菌和宿主互作关系中，病原菌中有一种转录激活效应子(transcription activator-like effectors (TALEs)，这个效应子的作用类似启动子，当宿主中没有抗性基因的时候，TALEs可以启动宿主中一些可以增强感病的基因来促进病原菌的侵染。面对这种病原菌，宿主的对策是进化出一种执行基因（Executor Genes）（也算是R基因的一种）。首先，这种执行基因可以引发（initiate）植物的抗病反应，其次执行基因的启动子序列跟TALEs也有很强的结合力。综合这两个特性，执行基因就可以捕获TALEs，让TALEs不能够去启动那些增强感病的基因，而是启动执行基因，进而引发下游防卫执行基因的表达。

⑦主动丧失感病性—阻断病原菌的主要策略 主动丧失感病性（active loss of susceptibility）通过过表达寄主免疫相关基因或特异性降解/减弱病原菌毒素的酶可阻滞病原菌的生活过程，从而实现抗病。这一类大多数具有广谱抗性，对多种不同的病原菌都有抗性，也有个别是专化抗性。大部分是组成型表达，个别也有特异性表达。如抗玉米圆斑病基因Hm1，编码基于NADPH的还原酶，能特异性参与降解圆斑病菌毒素。

⑧被动丧失感病性—在寄主中丢失与病原菌互作的关键靶标基因 寄主中直接“丢失”与病原菌互作的关键性感病因子而获得隐性的抗性，这是一种常见的机制。在马铃薯中，绝大多数鉴定出来的隐性R基因都抗病毒，通过编码突变后的4E或4G家族的翻译起始因子使其无法与病毒的转录本帽子结构相互作用，从而获得对马铃薯病毒的抗病性。此外，水稻中约有三分之一的抗稻旁叶螨和白叶枯病的基因都是隐性遗传。

⑨通过寄主的重新编程而被动的丧失感病性 寄主中通过突变细胞通路中的基因元件导致对多种病原菌呈现广谱抗性，这同样是一种常见的策略。这种类型的抗病跟第八种一样通常是隐性的。通常这一类型也叫成株期抗性Adult Plant Resistance (APR)，因为这种抗性往往在植物生长后期才会出现。这一类型最经典的就是大麦的MLO基因，显性MLO会抑制大麦的抗病性，而当MLO位点突变为non-functional的时候，也就是变为隐性的mlo，对抗病性的抑制丧失，从而使得mlo呈现抗性。类似的还有水稻中的抗稻瘟病基因Pi21，其编码的HMA区域能够抑制植物的防卫反应，而一旦HMA区域功能丧失，其等位基因（隐性基因）就具有了广谱抗性。

对⑧和⑨丧失感病性的小结：首先，在这里，显性跟隐性基因可以简单的定义为有功能的蛋白（显性基因）和失去功能的蛋白（隐性基因）。在⑧的病毒例子中，由于病毒本身产生的蛋白非常有限，它必须利用宿主的蛋白来进行核酸复制，所以当宿主相应的蛋白是正常的有功能的时候，病毒顺利利用并造成病害；但是当宿主中的这个蛋白突变为无功能时（对宿主本身也有一定负面影响），病毒不能进行复制，所以植物在这时就是抗病的。而在⑨的例子中，在宿主中存在一种抑制抗病反应的蛋白（这些蛋白可能有其它重要作用），所以当这个蛋白是有功能的时候，病原菌可以顺利侵染造成病害，但当植物中的这个蛋白失去作用后，抗病机制顺利得到发挥，所以就表现为抗病。总之，⑧和⑨是典型的感病为显性，植物通过loss function（变成隐性）来达到抗病，但其中又有细微的差别。

      另外，基于衰老策略的抗性(senescence-associated resistance)也广泛存在于小麦中，多抗位点（三锈+白粉）Lr34/Yr18/Pm38编码蛋白通过运输抗性相关的代谢物而影响病原菌的生长，达到抗病的目的；Yr36基因编码蛋白高温条件下可以结合条锈菌的脂质，使病原菌的构造发生改变而抗病，进一步研究表明，编码蛋白通过跨膜运输进入叶绿体，与类囊体抗坏血酸过氧化物酶结合使其磷酸化，干扰其分解过氧化氢过程，造成过氧化氢积累，从而加速细胞死亡，有效地限制了条锈菌在小麦叶片组织内增殖；类似的成株期抗病基因Lr67/Yr46，编码一个己糖转运子蛋白，通过产生杂二聚体来减少植物细胞自身对葡萄糖的吸收，从而抑制活体寄生菌的生长和繁殖。3个已克隆的小麦成株抗性基因，抗病机理都是与能量代谢和糖转运有关，这些基因表达，在抗病性加强的同时，也加速细胞衰老和死亡。

     随着技术的不断进步，越来越多的抗病基因会被挖掘出来，可能新的抗病机制也会探究出来，我想这也就是作者为什么标题会用到 "to the nines"（不断接近完美）的原因吧。