小年刚过，不知还有多少奋战在一线的科研工作者们，大家请举个手报个数，算了，反正我也看不见。年终汇报刚刚结束，胖丫和凯凯都回家了，剩下我们几个默默看着空荡荡的实验室心里莫名的难受。这时微信传来胖丫发来的一篇文章，她还说：“师兄，你看看这个文章，也许对你现在一筹莫展的工作有所启发。”还是胖丫懂我，一语戳中我的痛点，之所以不回家了，还不是因为实验进展缓慢......

       今天小编简单解析一篇发在生物预印本上的文章，题为 Chromosome-scale comparative sequence analysis unravels molecular mechanisms of genome evolution between two wheat cultivars。从染色体水平上分析比较两个小麦品种的序列阐明基因组进化的机制，看了下作者，正是利用单染色体测序克隆Lr22a的作者们，克隆Lr22a文章的我们也曾解析过，小麦未知基因克隆系列（二）。

作者前期利用单染色体测序结合图位克隆拿到了抗叶锈基因Lr22a-2DS，见下图。

     顺势利用拼接好的2D染色体基因组（小麦材料CH Campala Lr22a）与中国春2D染色体基因组做了比较分析，目的是鉴定出较大的结构变异（structural variations, SVs），而结构变异主要包括序列的插入缺失（InDels）和拷贝数变异（copy number variation, CNV）。此外，作者还发现携带高密度SNP变异的单元型结构域（haploblocks）。

     首先，作者将二者BLAST比较后发现约99%的序列是一致的，而二者独有的基因各在0.36-0.63%。然后作者开始鉴定InDels，他们把焦点放在>100Kb上，其标准是在一些“断点区”的上游和下游没有gap，这样作者成功鉴定出四个大的InDels，分别为285 kb、494 kb、765kb 和677 kb，有趣的是其中三个都涉及了抗病基因nucleotide binding site –leucine-rich repeat (NLR) 的拷贝数变异。

不平等交换（Unequal crossing over）引起中国春中的285kb缺失。以往的研究表明这种不平等交换常常发生在重复单元序列区域，导致缺失或者多拷贝。如本文中发生在中国春上的285kb缺失导致中国春只剩下一个NLR单拷贝，而在CH Campala Lr22a中实际包含了两个NLR基因，作者推断是中国春的祖先在复制过程中发生了不平等交换引起，见图1c。这种假设绝非空穴来风，因为进一步比较发现中国春的这个NLR基因的5'区域的序列与CH Campala Lr22a中的NLR1基因相似，而3'区域的序列却与NLR2基因更相似！且NLR1和NLR2之间只有大量重复序列不含有任何基因。

双链断裂修复（Double-strand break repair，DSB repair）导致中国春另一个494kb的缺失。作者分析这一缺失去发现存在典型的DSB repair鲜明特征，即在断点区两端末端处都有“CGA”核苷酸的出现，而在中国春中只出现一个该拷贝。见图2。

大量的高密度SNP变异单元型（haploblock）结构域表明该区域为基因交流频发区。通过统计SNP密度发现在2D上出现三个高密度区，见图3a的a、b、c。其中haploblock a在染色体短臂末端包含Lr22a基因，作者认为这个单元型是由人工利用四倍体小麦（AABB）和山羊草（DD）杂交产生的，并通过系谱追溯了该材料的历史渊源；haploblock b和c目前无法追溯，可能是自然基因交流或者人工杂交引起；但作者通过设计haploblock c特异性标记（introgression-specific PCR probe）证实小麦材料CH Campala Lr22a的基因渐渗可能是通过CIMMYT品种这一推论。

全染色体比较研究NLR基因发现其呈现不同的拷贝数变异。作者发现这4个InDels有3个都与NLR基因的拷贝数变异有关，共在CH Campala Lr22a上鉴定出161个NLRs，而中国春有158个NLRs，且这些NLRs大部分都成簇分布且在端粒处密集。见下图。

且两个材料之间分别有两组拷贝数变异较大NLRs区域，见下图。

       小编不是做生信的，突然觉得胖丫回家对我的打击有多大，还好和胖丫及时沟通，好多都是在她的帮助下理解的。不过在理解的过程中，倒是给正在做抗病基因克隆的小伙伴们提了个醒，那就是不能只单纯的依赖于中国春的序列，可能在图位的过程中存在很大的gap！算了，还是乖乖的筛自己的bac文库吧。