由于基因组巨大、重复序列多并且染色体存在大量的低交换率区域，大麦或小麦的图位克隆工作往往比较困难。对于基因组较小的拟南芥来说，通过对作图群体进行全基因组重测序，在不依赖于交换或重组的基础上，研究者很能容易地拿到目标基因。但在基因组较大的大麦或小麦上，全基因组重测序的花费较高。同时，对于六倍体小麦来说，不同亚基因组之间高度相似也给数据分析带来了挑战。

       目前也有很多的方法来减少大麦或小麦基因组的复杂度，比如外显子捕捉技术、RNA-Seq技术以及本文将要介绍的染色体分离测序技术等（Sánchez-Martín, Javier, et al. "Rapid gene isolation in barley and wheat by mutant chromosome sequencing." Genome biology 17.1 (2016): 221.）。利用外显子捕捉技术已经成功分离到大麦光敏色素C基因、大麦多节及矮化基因以及小麦秆锈抗病基因Sr22和Sr45等，但外显子捕捉测序技术也有其明显的缺点：一是存在捕捉效率的问题，也是就是说并不是所有的外显子都能捕捉下来；二是无法捕捉未注释的新基因，比如小麦上的条锈病抗病基因Yr36和太谷核不育基因Ms2。RNA-Seq技术尽管能够弥补外显子捕捉技术的部分缺点，但却受到样品组织、取样时间或测序深度等因素的影响。利用流式细胞仪技术可以将具有目标性状基因的大麦或小麦单条染色体分离出来，再结合高通量测序技术，通过比较不同突变个体之间的差异应该可以快速定位或分离目标基因（MutChromSeq技术）。这三种方法的比较可见下表：

       为了验证该方法（MutChromSeq）的有效性，作者首先对大麦无蜡质基因（Eceriferum-q，位于2H染色体）的6个突变体以及野生型材料Foma进行了2H染色体的分离测序，并利用de novo组装技术获得了40多万个contig。通过与野生型材料进行比对之后发现，一共有57个contig在3个突变单株中存在突变，5个contig在4个突变体中存在突变，1个12Kb的contig在5个突变体中存在突变。进一步分析之后发现，在12Kb contig中不存在突变的单株为混杂单株。在这12Kb之中，作者利用野生型材料的转录组数据及公共数据库鉴定出了一个全长转录本，该转录本就是已经报道的无蜡质基因Eceriferum-q。同时，作者又利用常规测序方法对5个突变体的突变位点进行了确认。因此，MutChromSeq应该是一种非常快速有效地分离大麦未知基因的方法。

       同时，作者又利用小麦白粉病抗性基因Pm2（位于5D染色体）的6个突变体进行了验证。经过染色体分离测序之后鉴定出来两个候选contig，其中之一与野生型差异较大，可以排除EMS诱变的可能，被认为是组装错误；第二个contig含有一个编码R基因类型的转录本，利用该序列开发的分子标记与Pm2基因共定位。另外，对这6个以及另外6个Pm2突变体进行常规测序发现，在该R基因上分别有5个无义和7个错义突变，所有的突变都是EMS诱导的突变类型，即G/C到A/T。因此，该R基因很可能就是Pm2基因。

MutChromSeq利用流式细胞仪对目标突变体的目标染色体进行分离，从而大大降低重测序的难度。当然，为了获取未知基因所在染色体，我们往往需要进行一些简单的遗传分析。该方法并不需要对目标基因进行精细定位，同样也不依赖于目标基因所在区间，比如近着丝粒区域的正常重组交换。该方法的核心肯定是染色体分离技术了，染色体分离需要用到细胞遗传学、流式细胞计数、分子生物学以及流式分选仪等技能或仪器。如果仅仅为了分离少量未知基因而去建立这一套体系，显然有点得不偿失了。目前掌握这套核心技术的应该还是捷克Jaroslav Dolezel实验室，好在是他们非常善于合作，感兴趣的老师或同学可以和他们联系。

       另外，利用流式细胞仪分离到的染色体数量并不足以进行建库测序，需要进行扩增。扩增采用多重置换扩增（multiple displacement amplification, MDA）的方法，该方法不同于常规的PCR技术，而是利用随机引物和等温扩增以获得高保真的DNA大片段，可获得高覆盖率高保真性的全基因组扩增产物，具体原理大家可以自行搜索。