年末的惊喜一：小麦锈病史上具有里程碑意义的进展！

昨天Science期刊连载两篇锈病无毒基因克隆的文章。建辉看到之后非常激动，我们打算好好学习下，也就没在第一时间介绍给大家。今天让我们详细解读这两篇题为“Variation in the AvrSr35 gene determines Sr35 resistance against wheat stem rust race Ug99”和“Loss of AvrSr50 by somatic exchange in stem rust leads to virulence for Sr50 resistance in wheat”的文章。

在解读之前，先简单介绍下锈病的故事。锈病是禾谷类作物中一类最严重的病害之一。迄今为止，除了在水稻上未发现锈病外，其他常见的作物尤其是小麦及其近缘种如大麦，黑麦，燕麦，黑小麦等都存在锈病。所有的锈病都是由专性活体营养的真菌引起的，且它们具有转主寄生的特点（玉米除外，目前还未知），比如对于小麦的秆锈病和条锈病都能够侵染灌木小檗（bò），而这两种病原菌分别在小麦和小檗上完成无性和有性阶段，见下图。

这方面更加详细的阐述可以参见综述“Role of AlternateHosts in Epidemiology and Pathogen Variation of Cereal Rusts”。还有一篇中文文献“小麦条锈菌致病性及其变异研究进展”。

下面还需要介绍下病原菌和寄主之间的互作关系，在这里必须提到两位病理界的大牛Jonathan D. G. Jones和 Jeffery L. Dangl教授，他们总结提出经典的“四阶段的拉链模式”，又称“Z”或“之”字模型，见下图。

即1）植物模式识别受体（pattern recognition receptor, PRRs）识别微生物保守的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），激活PAMPs分子引发的植物的先天免疫反应（PAMP-triggered immunity, PTI）使得大多数的病原物不能致病；2）某些进化的病原物分泌出一些毒性因子，抑制寄主PTI导致植物产生效应因子激活的感病性（effector-triggered susceptibility, ETS）；3）植物进化出专化抗病基因（R-gene），直接或间接识别病原物特异拥有的效应因子（effectors），寄主产生效应因子激活的免疫反应（effector-triggered immunity, ETI），ETI加速和放大PTI使植物产生抗病性；4）寄主-病原物相互选择，协同进化，即在寄主抗病性选择压力下迫使病原物产生新的效应因子或者增加新的额外的效应因子来抑制ETI，而植物在病原物选择压力下产生新的R基因以激活ETI维持自己的生存。具体可参见综述“The plant immune system（Jones, J. D. G., and Dangl,J. L. 2006）”和“Pivoting the Plant Immune System from Dissection to Deployment（Dangl, J. L., Horvath, D.M., and Staskawicz, B. J. 2013. Science）”。

植物免疫反应构成复杂的信号转导网络系统，不同信号途径之间相互交织、相互影响，参与免疫反应的大量受体基因和防卫基因之间相互协同或相互拮抗，这些相互作用都可能对植物抗病性的广谱性和持久性产生影响。参与植物免疫反应的基因可以简单地分成两类：一类是受体基因，包括 R基因和 PAMPs识别基因（PRR）；另一类是防卫基因或防卫相关基因。防卫基因通过改变表达水平或蛋白翻译后修饰来对病原物的侵入做出反应，一个特定的寄主植物中存在大量的防卫基因，其编码蛋白既可以作为防卫反应的激发子，也可以作为防卫反应的抑制子，植物抗病性状表现是由R基因和相应的防卫反应基因协同作用的结果，在这一过程中R基因处于“金字塔”顶部，是最关键因素。典型的R基因具有NBS-LRR结构【核苷酸结合位点（Nucleotide-binding-site，NBS）、富亮氨酸重复 （Leucine-rich repeat，LRR）】。对于ETI来讲，可以简单理解为“基因对基因学说”，即只有寄主的R基因识别了病原物的无毒基因Avr才能够完成典型的过敏性坏死反应。一般情况下，抗病基因和无毒基因都是显性的，注意这一点很重要，后面的内容都是基于此，如下图4。

关注锈病研究的同仁们不难发现，这两个无毒基因克隆的工作都是在前期积累的大量研究基础上完成的，即都率先完成了小麦的抗病基因Sr35（2013年题为Identification of Wheat Gene Sr35 That Confers Resistance to Ug99 Stem Rust Race Group）和Sr50（2015年题为The wheat Sr50 gene reveals rich diversity at a cereal disease resistance locus）的克隆。

Sr35先前被定位于一粒小麦的3AL^m，对秆锈菌Ug99具有良好抗性。之所以叫Ug99，是因为这种毒力超强的秆锈菌小种在1999年的Uganda（乌干达）被发现。它几乎对当时所有应用的抗秆锈基因都能致病，且传播极快，大有毁灭小麦生产之势，目前已变异出多个类Ug99致病群。因此广泛发掘对该致病类群的抗病基因尤为重要。同时可见Sr35及相关研究的意义。作者通过经典的图位克隆获得该基因序列，并通过单倍型分析、突变体、转基因等手段进行验证。在意大利面小麦和面包小麦中没有发现Sr35的存在，其具有潜在的很多应用价值。 Sr35是典型的R基因，具有coiled-coil, nucleotide-binding,leucine-rich repeat (CC-NB-LRR)结构。

Sr50是通过物理图谱定位、突变体筛选以及比较互补实验克隆的抗Ug99的基因，该基因位于在小麦-黑麦1RS.1BL染色体的1RS臂上。因为在小麦1RS染色体上抗秆锈病基因存在多态性，即源自Petkus黑麦的1RS具有Sr31基因，源自Imperial黑麦的1RS具有Sr50，源自Insave黑麦的SrAmigo。在众多推广品种中存在的Sr31丧失了抗性，Sr50在中国春-Imperial黑麦异染色体系以及澳大利亚小麦品种Gabo中，SrAmigo是在小麦1RS.1AL易位系品种Amigo中。Sr50和SrAmigo具有Ug99小种的抗性，Sr50是大麦Mla位点上的同源基因家族成员。Sr50同样具有典型的(CC-NB-LRR)结构。插一句, 这里要特别感谢电子科大杨足君老师对Sr50的介绍。

下面首先介绍AvrSr35这篇文章的研究。普遍认为，锈菌的无毒基因一般是编码一类只有300个氨基酸的分泌蛋白。尽管好多锈菌完成了测序，对于这类基因片段的分析很难，因为实在太多了！如何从上千个候选片段中捞出真正想要的东西摆在了所有做锈病的工作者面前。这里再说几个病理学上的概念，针对寄主来讲，有抗病/感病之说；针对病原菌来讲，有致病/不致病之说，即有毒/无毒。

秆锈小种RKQQC不侵染含Sr35的材料，作者使用EMS（甲基磺酸乙酯）诱变该小种，获得15个能够侵染Sr35材料的突变小种，说明锈菌的无毒基因Avr突变为avr。然而，在侵染初期，与野生型侵染寄主相比，无论从组织学观察还是从转录组水平上都没有发现突变体与野生型存在明显差异。由此，作者推测锈菌中可能还存在AvrSr35的功能冗余基因。由此可见该过工作的难度，这也让我想起了年初南京农大王源超团队在science上报道的病原菌的诱饵模式，生物体的复杂程度远远超过我们的想象。

作者并没有因此放弃，接着将野生型小种的基因组测序并组装，然后利用转录组进行基因注释，再将15个突变体的转录组数据与野生型比较发掘变异。经过比较发现，只有一个基因MF474174在所有15个突变体小种中都发生了突变，其中12个突变体含有的是无义突变(即终止密码子突变，使肽链合成提前终止)；一个突变体剪切位点发生了变化；另外两个在128个碱基处由缬氨酸变为异亮氨酸（V128I），见下图一和二。

这个候选基因编码578个氨基酸，比传统意义认为的效应子要大很多，且它与其他物种的所有已鉴定出来的效应蛋白没有相似性！作者在感病材料（不含Sr35）中做了该基因的表达分析，发现在感病材料中，随着侵染时间基因表达上调，见下图。但是这仍不能解释为啥12个突变的小种里该基因是无义突变却仍能致病的原因。

作者从田间搜集了12个对Sr35致病的小种和15个对Sr35不致病的小种，对这些小种进行了AvrSr35候选基因单倍型分析，发现除了一些碱基突变引起了Avr功能变异外，最重要的还有一个微型的转座子（MITE, miniatureinverted transposable element）插入到该基因的第六个外显子里，导致编码的蛋白提前终止，最终AvrSr35功能丧失。与其他真菌相比，锈菌基因组的转座子非常丰富，作者推断转座子的插入很可能是引起Avr效应子功能缺失的主要原因之一。究竟候选基因AvrSr35是否与Sr35互作，作者接下来又做了烟草和小麦的细胞坏死试验和利用GFP和YFP对二者进行了细胞学定位试验。结果证明AvrSr35能够引起Sr35产生坏死反应。当然更深一步的互作工作有待进一步研究。

这篇文章成功克隆了小麦秆锈病首个无毒基因AvrSr35，初步揭示了Avr与R互作，当然，还有很多很重要的致病机理有待发掘。不过，已经拿到了基因，验证的手段可能随着技术的发展会越来越先进，我们期待更好的结果！

接下来我们会继续介绍AvrSr50的解读，敬请期待。我们前面还介绍过小麦麦瘟病菌无毒基因的克隆工作，当然该工作也发表在science上,可以比较下这几篇文章的研究策略，掌握研究的思路。

欢迎关注“小麦研究联盟”