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戏说美脂LipidTalk-19:肝纤维化治疗新策略:FXR激动剂与类泛素化抑制剂联用

已有 2073 次阅读 2020-2-19 10:05 |系统分类:科研笔记

范琦婧,张林强

1.   文章来源介绍

中国药科大学天然药物国家重点实验室、药物代谢与药代动力学重点实验室郝海平团队于2020113日在Nature Communications上发表题为SUMOylation inhibitors synergize with FXR agonists in combating liver fibrosis的文章。报道了联合应用奥贝胆酸(obeticholic acid, OCA)和法尼酯衍生物X受体FarnesoidX receptor, FXR类泛素化抑制剂可有效治疗由CCl4、胆管结扎和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH引起的肝纤维化。

 

2.   研究背景及科学问题

FXR是治疗NASH和肝纤维化的一个有希望的临床靶点。OCA是一种有效的FXR激动剂。然而,在期临床试验中,OCA的治疗效果有限,其治疗NASH诱导的肝纤维化的有效率只有23%[1],远没有达到期望值。因此本研究的科学问题是探索新的方法来提高OCA和其他FXR激动剂的临床疗效。

 

3.  重要技术方法

本研究采用了4种小鼠的肝纤维化模型:CCl4,胆管结扎(bile duct ligation, BDL)和NASHHFHC以及MCD饮食饲喂)诱导的肝纤维化模型,以及体外分离HSCs(来源包括小鼠以及人类)。利用Co-IPELISA发现并验证FXR的类泛素化现象;利用过表达、敲低、点突变等技术研究类泛素化分子的作用;利用荧光素酶报告实验与Ch-IP的手段检测FXRPlin1的相互作用;应用RT-PCRWesternblot以及组织学检测等方法检测mRNA和蛋白的表达水平以及组织的表型。

4.   重要发现

1)预防性而非治疗性的OCA可以抑制肝纤维化

在药物的临床前和临床研究中,一个很大的问题是在大多数临床前动物模型中,FXR激动剂是在肝脏没有明显纤维化变化的阶段以预防性的方式给予,这与人类患者的实际治疗完全不同。本文中,作者用两种肝纤维化模型(CCl4BDL)分别以预防方式(用CCl4BDL诱导建模时同时给药)以及治疗方式(CCl4诱导4周后给药以及BDL手术8天后给药)给与相同剂量的OCA,结果发现预防性的OCA具有更好的疗效。同时体外细胞(CCl4BDL模型中分离的HSCs)水平实验以及NASH模型实验也验证了这一结论。

 

2)OCA对静息状态(没有被活化)的HSCs更有效

HSC的活化是肝纤维化的重要标志,而脂滴(lipid droplet, LD)的丢失是HSC活化的重要标志。从对照组与实验组(CCl4BDL)模型小鼠中分离HSCs经过OCA处理,发现OCA对对照组HSCs(即没有活化的)的促纤维化基因有很强的抑制作用,且能抑制LD的减少,而OCA对实验组HSCs(即活化的)的抑制作用很弱。

 

3)在活化的HSCs中类泛素化修饰降低FXR的活性

OCAFXR激动剂,可以使静息状态的HSCsShpsmall heterodimer partner mRNA的表达增加。但在活化的HSCs中,FXR激动剂(OCAGW4064 WAY-362450)使Shp mRNA的表达被抑制,这一现象与从健康者和NASH病人体内分离的HSCs中的现象是一致的。这些结果表明活化的HSCFXR的转录功能是减弱的,但由于FXRmRNA和蛋白水平几乎没有改变,因此,作者推测应该是存在某种翻译后修饰(post translational modifications,PTMs)影响了FXR的功能。接下来,作者检测了FXRPTMs,发现在活化的HSCs和纤维化肝脏中,FXR的类泛素化(SUMOylation)修饰增加。此外在NASH小鼠和病人的HSCs中也检测到了类泛素化修饰增加的现象。进一步研究发现,在哺乳动物表达的三种类泛素蛋白(SUMO1SUMO2/3)中,过表达SUMO1SUMO2可以增加FXR的类泛素化水平,但只有敲低SUMO1才能抑制FXR的类泛素化。突变FXR的三个类泛素化修饰位点(Lys122, Lys275Glu277)同样能降低FXR的类泛素化水平,且三个位点同时突变时,FXR几乎不发生类泛素化。上述结果表明,类泛素化修饰是调节FXR活性的一个关键因素。

 

4)类泛素化抑制剂能恢复FXR的活性与功能

作者发现,使用类泛素化抑制剂(GASP)可以抑制活化HSCsFXR的类泛素化,同时上调Fxr及其目的基因ShpmRNA水平。将体外分离的HSCs用添加或不添加SP(或GA)同时培养,发现在培养后激活的HSCs中,单独使用OCA不能增加脂质的积累,不能降低促纤维化因子的水平,而SPOCA联用可以增加脂质的积累,降低促纤维化因子的水平从而抑制HSCs的活化。这说明在活化的HSCs过程中,类泛素化抑制剂能够恢复FXR的活性和功能,从而达到抑制HSCs活化的效果。

 

5类泛素化抑制剂与OCA联用能抵抗纤维化

前文中作者在细胞层面研究了类泛素化抑制剂与OCA联用可以抑制HSCs的活化。接下来,作者同时用SPOCA治疗肝纤维化模型小鼠(CCl4BDLNASH诱导的肝纤维化模型),发现模型小鼠血清ALTAST水平降低、促纤维化基因的mRNA表达水平降低、ShpmRNA增加,同时该处理还能抑制LD减少、减少细胞外基质、抑制纤维化表型。这些结果表明,联合使用类泛素化抑制剂和FXR激动剂可能是治疗由毒素(CCl4)、胆汁淤积(BDL)和NASH引起的肝纤维化的一种有效方法。

 

6FXR激动剂通过调节Plin1稳定LD

根据上述实验结果,作者提出问题:类泛素化抑制剂是怎么恢复FXR的功能进而与FXR激动剂一起抑制HSCs的活化与肝纤维化?对此,作者猜测,由于LD的丢失是HSC活化的重要标志,FXR激动剂可能通过稳定LD来抑制HSCs的活化。为了验证这一猜测,作者体外培养HSC-T6细胞并将ROHFAs添加到培养基中,结果发现该处理增加了细胞中的脂质并促进了LD的形成,同时与纤维化相关基因的mRNA水平降低、α-SMA减少,这提示抑制LD的丢失可能有利于抑制HSCs的活化。由于LD的分解是由于LD相关蛋白的减少导致的,因此作者分析了Plin家族成员的mRNA水平,发现只有Plin1可以响应FXR激动剂的处理,且表达上调。在从Fxr-/-小鼠分离的HSCs中, Plin1mRNA水平是降低的,LD的量是减少的,但促纤维化基因的mRNA水平表现出明显增加。过表达Plin1可以稳定LD的含量,抑制促纤维化基因的表达,进而抑制HSCs的活化;反之,干扰Plin1时结果正好相反。此外,作者用荧光素酶报告实验与Ch-IP实验证实FXR能与Plin1的启动子区结合,从而调节Plin1的表达,且两者的结合能响应OCA的处理。这些结果提示Plin1LD的稳定及抑制HSCs活化方面具有重要作用,且其表达受到FXR的调节。

 

7)FXR的类泛素化修饰抑制Plin1的表达

在静息状态的HSCs中,使用OCA能上调Plin1的表达,当HSCs中过表达SUMO1时,Plin1则不能响应OCA的调节;相反,SP能使活化的HSCs恢复这一响应。从肝纤维化模型小鼠(CCl4BDLNASH诱导的肝纤维化模型)中分离HSCs,将其同时用SPOCA处理,作者发现该处理可以增加Plin1的表达。这些结果说明抑制FXR的类泛素化修饰和促进FXR转录功能能够上调Plin1的表达,从而导致下游的一系列效应。

 

5. 对领域贡献

首先,该研究发现FXR类泛素化修饰水平的增加可以活化HSCs,这是限制OCA及其他FXR激动剂发挥作用的关键因素。其次,FXR类泛素化抑制剂与OCA联用增强了OCA治疗CCl4BDLNASH诱导的肝纤维化中的疗效。最后,作者找到了Plin1,发现其作为FXR的靶基因,具有稳定LD进而抑制HSCs活化的重要作用。

 

6.   存在问题及分析

NASH及肝纤维化越来越对人类健康产生巨大威胁,本研究发现FXR类泛素化抑制剂与OCA联用增强了OCA治疗CCl4BDLNASH诱导的肝纤维化中的疗效,但同样是临床前的研究,其在临床上的具体作用和效果有待进一步研究,这也是药物研究与临床应用存在的巨大的鸿沟。另一个问题是,本研究仅在肝纤维化中做了实验探究,FXR类泛素化抑制剂与OCA联用对NASH其他方面(脂肪变性、炎症等)的具体疗效是怎样的?甚至对肝纤维化后期的肝硬化甚至是肝癌中是否也有相应的作用呢?这些问题还需要进一步的研究。

 

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-019-14138-6#Abs1

 

参考文献

Wang, H., et al., Noncanonicalfarnesoid X receptor signaling inhibits apoptosis and impedes liver fibrosis. EBioMedicine, 2018. 37: 322-333.


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