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CRISPR/Cas9同时编辑多个基因新思路

已有 1091 次阅读 2018-3-21 11:02 |个人分类:Life Science|系统分类:论文交流

 杭州师范大学植物RNA信号传导研究中心俞志明博士等为CRISPR/Cas9同时编辑多个基因提供了新思路
Multigene editing via CRISPR/Cas9 guided by a single-sgRNA seed in Arabidopsis

Zhiming Yu1†, Qiyuan Chen1†, Weiwei Chen1, Xian Zhang1, Fengling Mei1, Pengcheng Zhang1, Mei Zhao1, Xiaohong Wang1, Nongnong Shi1, Stephen Jackson2 and Yiguo Hong1,2,3

1. Research Centre for Plant RNA Signaling, College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China
2. Warwick-Hangzhou Joint RNA Signaling Laboratory, School of Life Sciences, University of Warwick, Coventry CV4 7AL, UK
3. Worcester-Hangzhou Joint Molecular Plant Health Laboratory, Institute of Science and the Environment, University of Worcester, WR2 6AJ, UK

       “Multigene editing via CRISPR/Cas9 guided by a single-sgRNA seed in Arabidopsis”是杭州师范大学生命与环境科学学院“植物RNA信号传导研究中心”发表的论文。在后基因组时代,功能基因组研究的重心逐渐由单一基因转向多基因功能的研究。CRISPR/Cas9技术简单、高效的优点使多基因同时敲除变得可行。在设计敲除靶点时,通常做法是针对一个基因设计一条Spacer。然而,CRISPR/Cas9技术存在潜在的脱靶风险,一对一的设计方法虽然提高了敲除效率,但每多加一条Spacer,脱靶风险率将呈指数级增加。

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      本研究以编码拟南芥核糖体大亚基AtRPL10亚家族的三个同源基因AtRPL10A (AT1G14320), AtRPL10B (AT1G26910) 及AtRPL10C (AT1G66580)为切入点,通过序列分析找到满足同时编辑三个基因的一条Spacer(A,B),利用Cas9同时编辑三个基因。观察拟南芥转基因T1代植株的表型,发现不同转基因阳性植株的生长出现不同程度的滞后(C,D);利用基于PCR的RFLP分析方法,确证Line9转基因植株的三个同源基因均存在基因编辑(E,G)。通过单克隆测序分析并统计(F,H-I),发现在Line9植株中,AtRPL10A, AtRPL10B以及AtRPL10C的编辑效率(包括点突变和缺失)分别为8.8%,3.8%及23.6%。如仅分析Line9三个同源基因敲除率(仅有碱基缺失,未测到碱基插入),则分别是6.86%,0.98%,21.43%。与AtRPL10A及AtRPL10C相比,AtRPL10B更加接近着丝粒,由此产生的敲除率差异,可能跟三个基因在染色体上的位置有关-即位置效应(J)。因此在敲除靶点设计的时候,建议首先查找目标基因间是否存在序列一致性;其次还要充分考虑目标基因在染色体的位置分布,针对靠近着丝粒附近的基因;同时应选择表达强度高的启动子来驱动Cas9核酸酶的表达。
      杭州师范大学植物RNA信号传导研究中心PI俞志明博士及指导的陈启元同学为论文共同第一作者,洪益国教授为通讯作者。中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康教授提供CRISPR/Cas9载体。该项目得到国家自然科学基金、国家转基因生物新品种培育重大专项及浙江省自然科学基金资助。
该论文已于2017年12月11日在JIPB网站在线发表(doi: 10.1111/jipb.12622)。

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