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流水账体实验小总结

已有 2660 次阅读 2012-4-9 20:01 |个人分类:流水账|系统分类:科研笔记|关键词:记录,注册,office,流水账,style| office, style, 记录, 流水账, 注册

   注册博客的时候是想着每天记录一点,结果看看上一篇的时间,妈呀都整整过去一个月零十三天了!太懒了该打。废话少说赶紧写吧要不然一拖又一个多月了呵呵。。。

     

   2月初进入实验室认识实验仪器,因为是新实验室统统灭菌准备实验。然后等商家送药品过来之类的到3月初正式上手做实验。因为是研一不时的还要上上课,拖拖拉拉一个构建质粒花掉一个多月的时间(而且只构成一个)。据说构建质粒是生物实验最基本的。

那就摆一摆我做的过程吧~~大致过程如下

1处理引物    

   刚从生物公司拿过来的引物是粉末状的,加缓冲液(或者双蒸水)构成100uM的母液,再将其稀释10倍成为待用工作液(10uM)。取其5ul再加45uldd水(先加水再加引物)构成50ul体系于1.5mlEP管中。然后再加入模板(我们用的是Hela基因组DNA)和酶(我们用的是天恩公司的MIX酶)然后设置PCR程序,其延伸时间则根据目的片段的长度和酶的特异性来确定。

酶切(提前半小时准备制冰

  20ul体系,酶(1ul+DNA(5微升)+10*buffer(2ul)+12uldd水补齐至20 ul。水浴锅37度过夜。

3 连接(提前半小时准备制冰

   用20微升体系(T4链接酶[1u]l+10*buffer[2ul]+d-pcr(1)[12ul]+d-pGl3[5ul]  然后16摄氏度过夜。

4 转化(提前半小时打开水浴锅和制冰机

   取感受态细胞一管(100ul)分装两管分别加链接液4ul(连接液应为感受态细胞的十分之一量)于两离心管中,冰浴30min,然后将其放入水浴锅内(42度小于一分钟)。再冰浴2-3分钟(过程要轻拿轻放)。再加450ul无抗生素的LB(准备摇床  150/min 45min)。在45分钟期间准备超净台(紫外照射15-20分钟)然后抽100ul准备涂板。涂板用含氨苄的固体LB,涂完后放放置37度烘箱过夜。

5 挑单克隆(提前30min打开制冰机,标号EP

   如挑出18个则配20份的量,最后加模板。

   模板(一个单克隆加10uldd水取1ul出来)+引物R和引物F各一微升+10ul 2*混合酶+7uldd水补齐至20微升。然后PCR一个半小时30个循环。

6 扩增质粒(打开摇床设置参数

5mlLB +5ulAmpr+10ul菌液  37250/min过夜。

7.提取质粒(提前打开制冰机

  1)取1.5ml培养物入微量离心管,12000/min*2,弃上清,将离心管倒置,是液体尽可能流尽。

  2)往细菌沉淀中加溶液I,剧烈振荡,使菌体分散混匀。

  3)加溶液Ⅱ250ul,轻轻正反晃动6-8次,并将离心管放置在冰上2-3分钟。使细胞裂解。

  4)加150ul预冷的溶液Ⅲ,见白色絮状沉淀(可在冰上放置3-5min)

  5)加入450ul苯酚/氯仿/异戊醇,振荡摇匀,4度离心12分钟。

8酶切(提前打开制冰机水浴锅)

2  0ul体系,酶(1ul+DNA(5微升)+10*buffer(2ul)+12uldd水补齐至20 ul。水浴锅37度过夜。

注:跑胶在酶切,质粒扩增,PCR 过程进行完毕之后均涉及。主要是检查或回收之类。

期间一些细微的注意事项没有写进去,可能在做的时候会自然而然的带进来。

具体的操作步骤其实每个试剂的说明书上都附带着有,原理,因为是一些很基本的操作,生物秀,生物在线,科学网上一搜一大把。但鉴于是自己是初次接触生物实验,以作纪念啦。



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1 徐长庆

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