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NgAgo可能比较难实现 精选

已有 10015 次阅读 2016-8-19 19:46 |个人分类:杂谈|系统分类:科研笔记| NgAgo, 基因编辑机理

精读韩博士的文章,个人认为NgAgo实验中有几个可能比较重要的问题需要考虑。不管重复实验的目的是质疑、证实或是其它,起码作者在文中已经提及的注意事项不应该忽略。本文还试图以个人经验判断哪些是韩实验中需要特别注意的问题,但限于本人水平,说的也许是错的,请专家指正。


1.       溶解DNA的水的pH不用纠结,转染时其体积仅为培养基的1/100,不会对培养基的pH产生有意义的影响;

2.       细胞生长:韩在文章中多次强调了“Since NgAgo follows ‘one-guide faithful’ rule, i.e. guides can onlybe loaded when NgAgo protein is in the process of expression”,强调NgAgo在表达后才与gDNA结合。细胞应处于活跃生长期才能大量表达蛋白,因而,“90% confluence of the cells on harvesting isideal. Cell overplating significantly weakens the efficacy of genome editing.”表明这个实验中NgAgo要发挥功能,不要以为细胞收集越多越好,而是生长活性越高越好。建议收集对数生长期细胞,而不是平台期细胞。同时建议转染前利用无血清培养基等方法对细胞进行同步化,可以使蛋白表达时间更统一(这不是韩博士提到的);

3.       转染频次:蛋白表达一般在转染后24-48 hr开始,表达可持续3天。我一开始考虑如果需要多次导入gDNA,应该在24 hr后再加转一次,而不是韩博士说的首次后“81224 hr”。然而,从这个实验中表明NgAgo表达后结合gDNA的时间窗在0-12 hr内,若推迟24 hr再转gDNA则结合量明显减少(图2b)。这意味着需要为NgAgo准备足够量的gDNA,让它们一被表达就有guideDNA结合,一旦表达后超过12 hr没有gDNA,它们结合gDNA的能力就大大下降了(不知道为什么);

2b

4.       gDNA的纯度是不是问题?当然是。从图S156道可以看出,若5‘-P的无关序列(NC)与NgAgo结合,切割作用就没有了,即使再加入设计gDNAFW)共孵育也不行。考虑到一般情况下设计gDNA纯度应该足够高,且NgAgo似乎不与没有5’-PssDNA/ssRNA或者5‘-PssRNA结合(图2a),所以这个问题应该不是重点;

S1

2a

5.       Cas9-gRNA系统比较:Cas9-gRNA可以在体外结合形成核蛋白复合体后再送入胞内,这在一定程度上可以保护gRNA不在胞内降解,而纯化的NgAgo不能在体外结合gDNA37)(图2c)。这说明这两种蛋白在作用机制上不太一致。NgAgo必须与gDNA共转才能体现酶切作用。共转能结合,共孵育不能结合(图S1),这是我很难理解的地方之一。我只能猜测当NgAgo表达后非常容易与5’-P-ssDNA结合,一旦没有这样的“底物”将很快失活,即使提纯NgAgo也已失去活性;

2c

6.       定位问题:原核生物没有核膜,NgAgo发挥作用没有胞内定位问题。而在真核生物中,NgAgogDNA的定位应该是个问题。这也是我发现韩博士在做基因组编辑(图4)时特别提到设计了NLS-NgAgo的原因(NLSnuclear localization signal),并有图S4表明表达的NLS-NgAgo确实能够定位于核内(在Addgene给出的NgAgo质粒也是NLS-NgAgo)。但作者并没有提到gDNA的定位。由于NgAgo会在内质网表达后再定位于核内,NgAgo-gDNA复合体是在胞质内形成?还是进入细胞核内才形成?还是根本不形成复合体,是由gDNA入核,与靶序列结合后引导NgAgo来切割?从文章的描述中尚无法判断机理。我个人猜测第三种可能性更大些,这解释了共转才能结合,共孵育就不结合的原因。由于ssDNA使得dsDNA解旋必须与NgAgo的结合同步,这也可能是NgAgo基因组编辑成功率较低的原因;

S4

综上,NgAgo可能真的比Cas9难实现得多,应该需要改进



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