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178 新型狂犬病疫苗

已有 1305 次阅读 2021-1-31 19:54 |个人分类:狂犬病疫苗|系统分类:科普集锦

 

 摘要

需要有比现有疫苗更便宜、免疫原性更强的新型狂犬病疫苗来降低狂犬病的死亡人数。这种疫苗还将允许狂犬病疫苗在儿童免疫计划中得到更广泛的应用。许多佐剂可以节省现有疫苗以及替代疫苗,包括蛋白质疫苗、基因修饰的狂犬病病毒、假病毒和不同类型的核酸疫苗,目前正在进行临床前研究。其中一些已经进入早期临床测试。本章描述了这些不同狂犬病疫苗在暴露前(PrEP)或暴露后(PEP)免疫中的潜在用途。

由狂犬病病毒至少包括3个进化群群和7种基因型,每年夺去55,000多人的生命。大多数病例是由狂犬病病毒RABV)引起的,狂犬病病毒属于进化群1狂犬病病毒,是目前狂犬病疫苗的基础。15岁以下的儿童占狂犬病人数的40%。狂犬病病毒最常由传播,尽管其他哺乳动物如猫、浣熊、臭鼬、狐狸、狼、蝙蝠和其他动物也能传播病毒。在北美,接触到患狂犬病的蝙蝠是导致人类狂犬病的主要原因。在整个美洲和欧洲,犬的强制免疫已经大大降低了狂犬病的发病率,但是在亚洲和非洲流浪犬很常见,这种方法还没有成功。野生动物口服狂犬病疫苗在西欧和中欧减少了人类狂犬病病毒的暴露,但在美洲人口密度较低的地区和其他地方更具挑战性。

人们可以获得安全有效的狂犬病疫苗。它们基于狂犬病病毒,该病毒生长在组织培养物或胚蛋中,然后被灭活。由于狂犬病的潜伏期相对较长,因为它们主要与患狂犬病的动物的咬伤有关,疫苗通常在暴露后注射。狂犬病疫苗被预防性地提供给高危人群,如兽医、野生动物研究人员、洞穴探险者或与病毒打交道的个人。最近,秘鲁选择将狂犬病暴露前预防(PrEP)纳入高度流行的偏远地区的儿童免疫计划,以降低因儿童接触狂犬病吸血蝙蝠而导致的死亡率上升。最近,菲律宾实施了类似的国家计划。目前,经许可的狂犬病疫苗免疫原性相对较低,因此需要反复注射才能获得足够的中和抗体滴度,这与预防感染有关。对于PrEP,接种狂犬病疫苗3次,以可靠地诱导0.5IU/ml中和抗体滴度。尽管狂犬病疫苗能诱导持久的记忆B细胞反应,抗体滴度最终下降,需要定期加强免疫。对于暴露后预防(PEP),伤口需要彻底清洗,暴露后尽快开始注射狂犬病疫苗3-4次。在严重暴露的情况下,即通过经皮叮咬或抓伤以及与唾液或蝙蝠的粘膜接触而暴露的情况下,疫苗与狂犬病免疫球蛋白(RIG)结合,狂犬病免疫球蛋白应直接渗透到咬伤部位。狂犬病疫苗和RIG广泛使用,因此未得到充分利用,再加上对狂犬病病毒传播方式的长期忽视和获得医疗保健的机会有限,导致了与狂犬病相关的高人类死亡率。

免疫原性疫苗,在单剂量后达到中和病毒的抗体滴度,并且成本较低,预计将增加公众获得PrEP和PEP的机会,从而减少因狂犬病导致的人类死亡。目前,可以通过使用皮内注射而不是肌肉注射来降低成本。皮内注射,疫苗可以很容易地接触到皮肤中丰富的树突细胞网络,这在肌肉组织中更为稀少。因此,皮内免疫可以引发更强的免疫反应,并减少疫苗剂量。目前狂犬病疫苗的皮内免疫剂量比肌肉注射剂量低5-10倍,可诱导足够的抗体滴度。另一种降低狂犬病疫苗接种成本和提高推荐方案依从性的方法是减少疫苗剂量,并将免疫接种时间从几周缩短到一周(https://www.who.int/rabies/PEP_Prophylaxis_guideline_15_12_2014.pdf)。

到目前为止,这些狂犬病疫苗接种的变化并没有降低狂犬病疫苗的效力,这些变化现在是由世界卫生组织推荐的,并且在此之前已经在许多狂犬病流行国家广泛使用。

本章讨论了正在开发的新型人类狂犬病疫苗的利弊。

 疫苗诱导的免疫相关保护

对狂犬病病毒感染或传播的保护是通过中和抗体来介导的,所述中和抗体在丽莎病毒进化群1中的病毒种之间发生交叉反应。由当前疫苗诱导的抗体不能中和进化群2和其他遗传上不同的丽莎病毒。中和抗体是针对狂犬病病毒糖蛋白的,狂犬病病毒糖蛋白是弹状病毒体表面唯一表达的蛋白质。病毒糖蛋白以三聚体形式存在,大多数中和抗体针对构象依赖性表位。因此,狂犬病疫苗必须以其天然构象表达病毒糖蛋白,以诱导中和抗体。记忆B细胞对当前狂犬病疫苗的反应是持久的,并且可以在最初免疫后的几十年内回忆起来。因此,接种过疫苗者再次暴露于狂犬病和相关丽莎病毒的接种个体只需要两次强化免疫而无需RIG,而不是完整的PEP方案。诱导B细胞对狂犬病疫苗的反应需要CD4+ T细胞的帮助。因此,对患有T细胞免疫缺陷病的个体(如艾滋病患者)进行疫苗接种可能不会产生足够的抗体滴度。狂犬病病毒的大多数抗原,包括糖蛋白,携带辅助性T细胞表位。CD4+ T细胞和B细胞的诱导需要刺激最初的先天反应来驱动抗原呈递细胞的活化。目前许可的狂犬病疫苗不含佐剂,并依赖内在病毒因子诱导炎症反应,如激活Toll样受体7/8的单链核糖核酸基因组和激活RIG-1解旋酶的双链环。

下一代狂犬病疫苗的要求

新型狂犬病疫苗需要在安全性和效力上与现有疫苗相当,并超越其免疫原性,以实现单剂量方案和总体成本降低。它们需要诱导先天免疫,这可以通过佐剂来实现。佐剂通过驱动Th1细胞或Th1细胞的活化来影响免疫反应的类型。两者都促进B细胞的刺激和亲和力成熟,但它们实现不同类型的类别转换。人类的Th1细胞促进IgG1和免疫球蛋白IgG3的刺激,而Th2细胞的反应有利于向IgG4和IgGA的转换。尽管目前还不知道哪种抗体同种型最适合保护人类免受狂犬病的侵害,但在小鼠身上获得的一些证据表明,在中枢神经系统中可以更容易地诱导出具有Th1连锁同种型的抗体,在中枢神经系统中它们可以促进病毒清除。新型疫苗必须以其天然形式表达狂犬病病毒糖蛋白,并且它们需要诱导一种抗体反应,该抗体反应广泛中和所有进化群1丽莎病毒。中和不属于进化群1和进化群2狂犬病病毒或其他最近分离的狂犬病病毒是理想的。疫苗应该诱导持续的抗体和记忆B细胞反应。用于PEP的疫苗必须在病毒扩散到神经系统之前迅速诱导抗体反应系统。由于发展中国家最急需价格较低的狂犬病疫苗,疫苗必须是热稳定的,因为冷链昂贵且难以维护。交付需要简单。

一些疫苗和疫苗佐剂已经过临床前和部分临床试验。一些符合用于PEP和PrEP的疫苗所要求的标准,而另一些仅适用于PrEP。

佐剂通过稳定抗原和/或影响其延长释放、靶向特定细胞或促进炎症反应来增加疫苗的免疫原性和效力。佐剂由于其本身的性质而具有后一种效果,增加了疫苗的反应原性,并且在极少数情况下甚至会导致严重的不良事件,如佐剂流感疫苗。尽管大量的研究工作集中在新佐剂的开发上,但很少有人获得许可。氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝(硫酸铝钾)或混合铝盐形式的铝盐在美国已经被批准60多年了。另外两种佐剂,即AS04氢氧化铝和单磷酰类脂A的组合,被批准与Cervarix(一种针对致癌型人乳头瘤病毒的病毒样颗粒(VLP)疫苗)和AS03(一种水包油乳剂)一起使用,用于H5N1病毒疫苗,目前在美国不用于人类,但在禽流感爆发时被储存起来。AS03已经在美国以外的47个国家与H1N1流感疫苗一起使用,它与儿童发作性睡病的增加有关。迄今为止,美国还没有其他佐剂获得许可,尽管许多佐剂已经过临床前和早期临床试验。表1列出了用灭活狂犬病疫苗在动物中测试的佐剂。大多数是在小鼠身上测试的,在小鼠身上,它们增加了对狂犬病疫苗的抗体反应,从而保护了免受攻击。需要注意的是,在啮齿类动物中获得的结果,尤其是针对病原体识别受体的佐剂,由于先天受体特异性和分布的差异,不一定能转化为人类。

在人类和非人灵长类动物中获得的数据表明,氢氧化铝辅助狂犬病疫苗将提供有限的优势。两种佐剂,ISCOMATRIXTM,一种由胆固醇、磷脂和皂苷组成的颗粒形成佐剂,和IMO-2170,一种对TLR-9具有激动活性的免疫调节寡核苷酸,在非人灵长类动物中产生了有希望的结果。一种佐剂,一种基于合成dsRNA类似物的TLR-3激动剂和用卡那霉素和钙稳定的聚肌肽-多胞苷酸的精制形式,已经在没有狂犬病暴露或疫苗接种史的人类志愿者中进行了试验。第1组接受4剂静脉注射方案(1-1-1-1)的RABIPUR,第2组接受与称为PIKA狂犬病疫苗的佐剂疫苗相同的方案,第3组接受加速3次注射方案的PIKA狂犬病疫苗,接种方案是 (2-2-1)。尽管第2组的1/12受试者因瘙痒而不得不退出试验,但该实验疫苗耐受性良好,最终症状得以缓解。第3组产生狂犬病中和抗体的滴度比对照组1快,抗体反应更持久。第2组表现出加速和延长反应的趋势,但未达到显著水平。尽管第一阶段安全性试验的结果是有希望的,但关于免疫原性改善的问题仍然存在。它们需要在更大的第二阶段试验中解决。具体来说,PIKA狂犬病疫苗最有希望的加速2-2-1方案与标准的1-1-1-1方案进行了比较,这就提出了一个问题,即更快和更强的反应是否确实是由佐剂或接种剂量和时间的差异引起的。

 

1用于常规狂犬病疫苗测试的佐剂

 佐剂

疫苗

种类

研究结果

氢氧化铝

 

HDCSV +佐剂与单纯或8-位点皮内注射方案的HDCSV相比

 

带佐剂与无佐剂单点皮内接种相似,优于8位点皮内接种

白介素-2,每日全身给药

狂犬病减毒SAD株

远交小鼠

 

通过用CVS-11病毒挑战来测试,疫苗效力增强 

 

分枝杆菌的极性糖肽

Semple 疫苗

BALB/c小鼠

通过用CVS病毒挑战来测试,疫苗效力增强。 

 

CpG ODN

(BW006)

灭活狂犬病疫苗

BALB/c小鼠

增加了中和抗体滴度,保护效果增加。

盘卷藻活化相关蛋白-1

维尔博狂犬病疫苗

BALB/c小鼠

增加了IgG1 和IgG2a抗体应答

ISCOMATRIX佐剂

Rabavert®

恒河猴

显著增加中和抗体滴度

IMO-2170,合成TLR9激动剂

Rabavert®

 恒河猴

显著增加中和抗体滴度

无定形羟基磷酸硫酸铝

Rabavert®

 恒河猴

微弱增加中和抗体滴度

5-三磷酸尿苷

商业狂犬病疫苗(单剂)

BALB/c小鼠

在暴露前免疫中可微弱增加中和抗体滴度

人参皂苷 

Rabvac®

远交的老鼠

提高抗体滴度、延长免疫持续时间

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白

灭活狂犬病疫苗

BALB/c小鼠

微弱增加抗体应答

板蓝根多糖IIP-A-1和IIP-2

灭活狂犬病疫苗

BALB/c小鼠

加速抗体产生、增加抗体滴度

氢化大豆磷脂和胆固醇脂质体

灭活狂犬病疫苗

BALB/c小鼠

微弱增加抗体应答

TLR-3激动剂

RABIPUR®

很好的耐受性、增加疫苗的免疫原性

 

蛋白质和多肽疫苗

蛋白质或多肽疫苗基于病毒糖蛋白,一种65-kDa蛋白质,包含胞质内结构域、疏水跨膜结构域和胞外域。合成后,蛋白质形成三聚体,在转运到细胞表面之前,在三个潜在位点中的一个位点被微小地糖基化。基于狂犬病病毒糖蛋白的蛋白质疫苗的优势在于它们非常安全,并且可以用于PEP和PrEP。根据蛋白质的来源,如植物细胞,它们也可能是有成本效益的。蛋白质疫苗的缺点是正确折叠成狂犬病病毒糖蛋白的天然三聚体结构,这是诱导中和抗体的关键,仍然是一个挑战。由于跨膜域的高度疏水性,全长糖蛋白的溶解性很差,然而这对蛋白质的正确折叠是必需的。

2 蛋白质狂犬病疫苗

表达系统

蛋白

免疫方案

物种

结果

蛋白疫苗

哺乳动物细胞表达系统

HEK-293

糖蛋白形成的VLP

两次免疫

小鼠

保护

BH-K21  

 

糖蛋白




NA

糖蛋白




昆虫细胞表达系统

Sf9

纯化糖蛋白+铝佐剂

2剂、200–400 ng

小鼠

保护

非纯化糖蛋白

~12–120  μg

小鼠、浣熊

保护

纳米糖蛋白

1–5  μg

小鼠

比Rabipur免疫原性好

5–50 mg


果蝇施耐德2细胞

糖蛋白




纯化糖蛋白

 3  μg  纯化蛋白

小鼠

适当的抗体应答

酵母表达系统

酿酒酵母

非纯化糖蛋白

酵母提取物

小鼠

无保护

巴斯德毕赤酵母

糖蛋白




毕赤·奥古斯塔酵母

截短糖蛋白




植物表达系统

玉米


50  μg ,1剂,口服

小鼠

保护


0.5–2 mg,1剂,口服

部分保护

烟草

纯化糖蛋白,弗氏佐剂

25  μg ,4剂,腹腔注射

小鼠

保护

菠菜

表达狂犬病病毒抗原决定簇的烟草花叶病毒

50  μg ,3剂,腹腔注射

远交鼠

部分保护

 

3剂,菠菜叶子,口服

在部分人中诱导初步和记忆性B细胞免疫应答











 

 2列出了已开发的不同类型的蛋白质和多肽疫苗。在哺乳动物细胞中产生狂犬病病毒糖蛋白,如人胚胎肾(HEK) 293细胞,幼仓鼠肾(BHK)-21细胞,或神经母细胞瘤细胞是糖基化的,尽管糖基化模式(其反过来影响蛋白质的免疫原性)根据宿主细胞类型而变化。它还受到培养条件的影响。在昆虫细胞系统中的表达,例如通过杆状病毒在甜菜夜蛾(Sf-9)细胞或果蝇Schneider 2细胞中的表达,也产生能够在小鼠中诱导病毒中和抗体的寡聚糖蛋白。一种由杆状病毒衍生的糖蛋白自发形成胶束(纳米颗粒),已经在小鼠中进行了测试。3剂方案比市售疫苗诱导更高的血清转换率。这种由CBL生物公司开发的疫苗已经在人体内进行了第一和第二阶段试验,并计划进行第三阶段试验。这些试验的结果尚未向公众公布。

在酿酒酵母中的表达导致在小鼠中不能产生免疫原性的蛋白质,这可能与酵母典型的高甘露糖糖基化模式有关。还评估了在甲基营养酵母毕赤酵母中的表达,得到至少部分正确折叠的蛋白质。相似的结果在毕赤酵母(多形汉逊酵母)中获得。这两种蛋白都没有在动物中诱导中和抗体,这是狂犬病病毒糖蛋白正确折叠和糖基化的最终测试。

狂犬病病毒糖蛋白已经在植物细胞中产生,包括玉米、烟草、胡萝卜或菠菜。后者表达糖蛋白和核蛋白的表位以及α嵌合病毒外壳蛋白,以促进口服疫苗的递送。植物细胞适当地糖基化狂犬病病毒糖蛋白。然而,口服免疫的成功是不同的。一种玉米衍生的糖蛋白以50 μg /剂的剂量在小鼠的籽粒中喂养,导致对吸血蝙蝠病毒的攻击的保护。嵌合菠菜衍生多肽疫苗最初在小鼠腹腔注射后进行测试,在三次剂量后获得保护性免疫。人吃三次含有嵌合狂犬病病毒肽的生菠菜,对预先没有接种狂犬病疫苗的志愿者接种一剂商业狂犬病疫苗,7天之后,9个人中有3个人产生了中和抗体,这表明植物疫苗至少在一些人类志愿者中引发了B细胞反应。在这项研究的另一个分支中,之前接种过商业狂犬病疫苗的人吃了相同的物质。在这一组中,5人中有3人表现出回忆反应。另一项研究在小鼠中证明了在烟草叶或胡萝卜中表达的纯化狂犬病病毒糖蛋白的免疫原性。

用一些表达系统获得的结果,特别是在HEK 293细胞中形成的病毒样颗粒和玉米产生的糖蛋白,是有希望的。除非糖蛋白用于口服免疫,否则必须进行纯化,这给蛋白质疫苗增加了另一层复杂性和成本。用原料如玉米粒、胡萝卜或菠菜叶进行口服免疫,不仅对摄入的物质,而且对最终呈现给免疫系统的抗原量,都可能带来精确给药的挑战。几个小组已经探索了肽的用途。一种分支脂多肽疫苗,具有或在没有TLR7激动剂的情况下,显示出诱导对狂犬病病毒的T细胞反应,这可以加速对传统疫苗的B细胞反应。在小鼠中测试的用犬gp69包被的基于多表位的疫苗显示出有限的效力。考虑到狂犬病疫苗需要诱导针对多种分离株和优选不同基因型的非常广泛的抗体反应,这种方法不太可能替代目前的疫苗。

转基因狂犬病疫苗

狂犬病病毒可以通过反向遗传学进行修饰。这导致产生了高度减毒的狂犬病病毒和/或免疫原性提高的病毒,可用于动物或人类疫苗接种(表3)。编码部分病毒聚合酶的P基因的缺失会减弱狂犬病病毒毒性。即使将该病毒脑内注射到具有免疫活性的成年小鼠或哺乳小鼠或免疫缺陷小鼠体内,该病毒也是致病的,尽管在免疫缺陷小鼠体内,P基因缺失的疫苗从外周扩散到中枢神经系统。P基因缺失的狂犬病病毒诱导病毒中和抗体反应。这种反应相当缓慢,但后来超过了基于野生型病毒的灭活疫苗,表明这种构建体可以考虑用于PReP,但不能用于PEP。为了增强缺失P基因狂犬病疫苗的免疫原性,对其进行了进一步修饰,以表达两个拷贝的病毒糖蛋白基因。这种疫苗能更快地在小鼠和非人灵长类动物中诱导狂犬病病毒中和抗体。基质(M)基因缺失的狂犬病病毒也是致病性的,不像P基因缺失的病毒不会扩散到免疫缺陷小鼠的大脑中。这种疫苗在小鼠中非常迅速地诱导出病毒中和抗体,而在非人灵长类动物中反应稍慢。两种类型的病毒都诱导Th1偏向的反应。

病毒减毒疫苗很有吸引力,因为它们比同等剂量的灭活病毒产生更高和更持久的抗原水平。然而,考虑到狂犬病几乎总是致命的,即使通过各种可能的手段证明活疫苗在动物身上是安全的,它也可能不会被监管当局或公众所接受。减毒狂犬病疫苗可用于治疗具有中枢神经系统狂犬病病毒感染活跃症状的人类患者。

为了克服这种潜在的安全性限制,携带两个糖蛋白基因拷贝的突变体被灭活,然后在犬中进行测试,与传统疫苗相比较。单次注射后,突变病毒诱导了加速的抗体反应,保护了80%的动物免受狂犬病病毒强毒株的攻击。这种疫苗可能适用于PEP,在PEP中,病毒中和抗体反应的发生速度至关重要。这种突变疫苗的另一个优点是,与亲代HEP-Flury株相比,它在BHK-21细胞中有更好的生长,尽管还需要更多的研究来评估这种疫苗是否能大规模生产。

表3转基因狂犬病疫苗

狂犬病病毒

疫苗类型

免疫方法

物种

结果

p基因缺陷型狂犬病病毒

减毒活病毒

 1剂,106FFUs,腹腔注射 

小鼠

诱导中和抗体和保护免受攻击。优于灭活狂犬病疫苗的功效。

修饰的P基因缺失的狂犬病病毒

减毒活病毒

 1剂,103-105FFUs,肌肉注射

 

小鼠

快速诱导中和抗体和保护免受攻击。

m基因缺陷型狂犬病病毒

减毒活病毒

1剂,103-105FFUs,肌肉注射

小鼠

 快速诱导中和抗体,完全预防病毒攻击。

2剂,2*107FFUs,肌肉注射

非人灵长类动物

诱导中和抗体

具有两个糖蛋白基因拷贝的狂犬病病毒

灭活病毒

1剂,

相当于107FFU和佐剂,皮下注射

轻微的加速犬中和抗体产生,83%的免受攻击保护率。

  

 

病毒颗粒疫苗

一些病毒可以被修饰以在病毒体表面表达狂犬病病毒糖蛋白(表4)。这些病毒与蛋白疫苗或基因修饰的狂犬病病毒有共同的优点,即蛋白可立即用于诱导免疫反应,从而有可能用于人免疫规划。此外,它们的优点是对母体病毒的炎症反应使它们独立于添加的佐剂。病毒的纯化方法有已被很好地证实并且不受狂犬病病毒糖蛋白特性的影响,例如其跨膜结构域的高度疏水性。潜在的缺点是对母体病毒的预先存在的免疫或适度水平的显示的狂犬病病毒糖蛋白,这两者都可能抑制对狂犬病病毒的免疫反应。人们还需要考虑由于母体病毒的致病性而增加的不良事件的可能性。

表4作为狂犬病病毒疫苗的假病毒

假病毒

免疫方法

物种

结果

新城疫病毒

1剂,感染剂量约106-108蛋感染剂量,肌肉注射

小鼠

完全保护

 

3剂,感染剂量约108-1010蛋感染剂量,肌肉注射

猫、狗

杆状病毒

2剂,108IFU,肌肉注射

小鼠

完全保护

 副流感病毒5

 

1剂,108PFU,肌肉注射、鼻腔免疫、口服,PrEP

 

小鼠

完全保护

3剂,107PFU,颅内,PEP

 

小鼠

部分保护

 新城疫病毒是一种禽副流感病毒,经修饰后在其表面表达狂犬病病毒糖蛋白。这种疫苗可以在含胚胎的鸡蛋中生长到很高的滴度,并且在小鼠、犬和猫中显示出安全性。它诱导高滴度和持续的狂犬病病毒中和抗体。单次肌肉注射剂量在小鼠中获得完全保护,而三次免疫方案显示保护猫和犬。

一种杆状病毒被修饰以在其表面表达狂犬病病毒糖蛋白,并在巨细胞病毒启动子的控制下同时表达另一种糖蛋白。因此,这种载体既可以作为VLP疫苗,也可以作为核酸疫苗。在小鼠中,一定剂量的重组杆状病毒诱导病毒中和抗体反应,并完全保护其免受病毒攻击。

表达狂犬病病毒糖蛋白的副流感病毒5载体被开发出来,并在最初的PrEP方案中进行测试,在该方案中,它们在小鼠中诱导中和抗体,并完全保护小鼠免受攻击。在同一项研究中,在小鼠中用PEP方案测试了假病毒。小鼠肌肉注射狂犬病病毒,然后在注射4-6天后开始,在脑内注射重组病毒三次。观察到临床症状显著减少,尽管应该注意到早期接种野生型病毒也减少了疾病。

尽管假病毒可能是PEP的一种经济有效的替代物,但还需要在更相关的动物模型中进行额外的研究。

 核酸疫苗

核酸疫苗是引入遗传物质或病原体转录物的疫苗。这种疫苗需要转化细胞。他们利用宿主细胞机制产生免疫原,然后刺激免疫反应。对核酸疫苗的免疫反应的开始被延迟,尽管这种延迟可能是微小的,并且蛋白质的合成预计将在数小时内发生,导致抗原在几天内的稳定积累,但是它排除了对PEP使用核酸疫苗,在PEP中中和抗体反应的速度决定了患者是活还是死。

已被探索用于狂犬病病毒疫苗接种的核酸疫苗可细分为mRNA疫苗、质粒载体或复制子形式的DNA疫苗、病毒和细菌重组疫苗(表5)。

mRNA疫苗

临床前研究表明,注射到动物转导细胞中的编码狂犬病病毒糖蛋白的mRNA可刺激针对狂犬病病毒的Th2偏向性抗体反应,从而保护小鼠和猪免受病毒的攻击。基于这些有希望的结果,在没有接触过狂犬病疫苗的人类志愿者中,在剂量递增试验中测试了编码狂犬病病毒巴斯德毒株糖蛋白的冻干核酸疫苗,命名为CV7201。疫苗在第0、28和56天肌肉注射2或3次,或在第0、7和28天皮内注射3次。注射要么用注射器,要么用注射器装置。90%的参与者报告了副作用,其中12%的副作用被认为是严重的。局部副作用在皮内注射后更常见,全身副作用在更高的疫苗剂量下趋于增加。通过注射器进行的肌肉或皮内免疫接种未能引发0.5IU/ml或以上的狂犬病病毒特异性中和抗体滴度。使用注射器意味着大约50%的人以最高剂量(400 μg /剂)肌肉注射疫苗,大约70%的人皮内注射疫苗的效价达到或超过0.5IU/ml。免疫后一年,所有个体的滴度降至0.5IU/ml以下。用注射器装置(80 μg /剂,3剂)皮内注射的一些个体在一年后用相同的疫苗剂量、途径和用于灌注的注射类型进行增强。增强后,约60%的个体抗体滴度达到0.5IU/ml以上。尽管这一原理性研究的证据表明,一种核酸疫苗可以在人体内诱发免疫反应,但试验结果远非令人印象深刻。考虑到狂犬病的严重性,不能在所有疫苗接受者中达到足够滴度的疫苗是不可接受的。

 5核酸疫苗

疫苗类型

免疫方法

物种

结果

mRNA疫苗

mRNA, PrEP

 2-3次,肌肉或皮下免疫,注射器或注射装置接种。

在一些志愿者中产生短期维持的中和抗体。

DNA 疫苗

DNA, PrEP

 1-2剂,肌肉或皮下免疫,0.1-50 μg ,注射器或基因枪接种。

小鼠

保护性免疫

编码嵌合糖蛋白的DNA,PrEP

1剂量,肌肉注射,50-80 μg ,心脏毒素处理后免疫。

小鼠

广泛交叉反应中和抗体滴度

DNA,PrEP

2剂量,肌肉或皮下免疫,100-300 μg  。

犬、猫

产生中和抗体可以抵抗活病毒攻击

DNA,PrEP

1剂,100-1000 μg 肌肉注射或6-60 μg 基因枪注射。

 非人灵长类动物

持续产生广泛的中和抗体,可以抵抗活病毒攻击。

 DNA +粒-巨噬细胞集落刺激因子佐剂,PrEP

1剂,1-5 μg 肌肉注射

小鼠

提高疫苗的效价

DNA +单磷酰脂质,PrEP

2剂,2 μg ,多种免疫途径

小鼠

初免后增加免疫应答

DNA +氢氧化铝,PrEP

1剂,100 μg 肌肉注射

小鼠

增加了抗体免疫应答、保护。

DNA +氢氧化铝或阳离子脂质,PrEP

2剂,200 μg 肌肉注射

增加了中和抗体

DNA +胺端聚(醚亚胺)树状大分子,PrEP

3剂,90 μg 肌肉注射

小鼠

增加了抗体免疫应答、保护。

DNA +Emulsigen-D,PrEP

3剂,100 μg 肌肉注射或1 μg 基因枪注射。

小鼠

增加了抗体免疫应答、保护。

DNA 初免,腺病毒载体加强免疫,PrEP

1剂,50 μg 肌肉注射

小鼠

增加了抗体免疫应答、保护。

DNA ,PEP

5剂,100 μg 肌肉注射+狂犬病人勉强球蛋白

小鼠

部分保护

1剂,100 μg 肌肉注射

小鼠

部分保护

DNA +Emulsigen-D,PEP

5剂,100 μg 肌肉注射。

小鼠

完全保护。

 复制子疫苗

Sinbis复制子疫苗

1剂,50 μg 肌肉注射。

小鼠

完全保护。

痘病毒疫苗

痘病毒

1剂,多种剂量,多种免疫途径。

多种动物

完全保护。

 改良安卡拉痘苗

1剂,107-109pfu,肌肉注射。

小鼠

部分保护。

金丝雀痘病毒

1剂

猫和犬

保护。

金丝雀痘病毒

1剂,103.5 –105.5 TCID50 ,肌肉注射。

诱导合适的中和抗体应答。

腺病毒载体

复制缺陷性腺病毒5

1剂,105-108IU,口服

鼠,臭鼬

在大多数动物中诱导中和抗体

复制缺陷性腺病毒5

1剂,2*104-2*106IU,各种途径

小鼠

肌肉免疫,完全保护。

复制缺陷性腺病毒25

1剂,5*103-5*107IU,皮下免疫、滴鼻免疫。

小鼠

在高剂量完全保护。

复制缺陷性腺病毒25

1剂,109VP,肌肉免疫。

非人灵长类动物

完全保护

 DNA疫苗

质粒载体也称为DNA疫苗,可以通过肌肉注射或真皮内注射给药。它们可以在用基因枪涂在金珠上时皮内施用。质粒局部转导细胞,然后产生抗原。继载体注射后,可通过电穿孔来提高转导率。DNA疫苗有明显的优势。它们很容易生产。它们是热稳定的。它们在载体基因组中以CpG序列的形式携带它们自己的佐剂,激活TLR-9 。他们在人体内的试验表明,他们的耐受性良好。它们诱导包括Th1型抗体在内的全方位免疫反应。免疫反应往往是持续的。它们的主要缺点是它们在动物中的强免疫原性没有可靠地在人体研究中体现。

几项研究测试了表达狂犬病病毒糖蛋白的DNA疫苗。初步研究表明,单剂50 μg 的注射用DNA疫苗可保护50%的小鼠免受攻击,而3剂可保护80%。随后的研究报告称,在单次肌肉注射10 μg 或基因枪注射2 μg 后,可获得完全保护。使用表达由1型和2型狂犬病病毒嵌合糖蛋白组成的的DNA疫苗或表达这两种病毒的全部糖蛋白序列的2种DNA疫苗,导致广泛中和抗体反应,中和大多数基因型狂犬病病毒。其他研究表明,在非人灵长类动物、犬和猫中诱导了病毒中和抗体反应,就测试而言,这种反应可以预防病毒攻击。可以通过添加以表达细胞因子的第二种DNA载体形式的遗传佐剂或通过在传统佐剂如单磷酰脂质、氢氧化铝、阳离子脂质、胺封端的聚(醚亚胺)树状大分子或乳化剂中配制DNA疫苗来增加反应。或者,可以通过使用第二种疫苗如腺病毒载体进行强化免疫来增强反应。在这样的初始增强方案中,通过预先存在的针对病毒疫苗载体的中和抗体,显示出DNA疫苗克服了转基因产物特异性B细胞反应的损伤。最初的研究集中在PrEP,尽管许多研究报道了在小鼠或非人类灵长类动物的PEP方案中使用狂犬病DNA疫苗降低了死亡率。

病毒复制子,例如基于 Sindbis病毒复制子,也显示在单剂量接种,在小鼠和犬中诱导中和抗体的保护水平。

其他病原体的DNA疫苗,如恶性疟原虫,HIV-1、汉滩病毒、埃博拉病毒和马尔堡病毒已经过临床试验。免疫原性是可变的。在临床试验中获得了更强有力的反应,这些试验使用了DNA疫苗初免,随后用病毒载体疫苗加强免疫。这种方法不会简化目前的狂犬病疫苗接种方案。

 病毒载体疫苗

重组病毒,类似于DNA疫苗,在体内感染细胞并转录插入序列后诱导免疫反应。它们比DNA疫苗的优势在于感染率更高,这与更强有力的先天免疫系统信号一起增加了它们的免疫原性。它们的安全性各不相同,那些复制缺陷型的,如E1缺失型腺病毒(Ad)载体通常耐受良好,而一些痘病毒载体的反应原性太强,不适用于人类。病毒载体疫苗的一个明显缺点是,它们的免疫原性在存在由自然感染或先前接种诱导的预先存在的载体特异性中和抗体的情况下降低了。因此,它们适用于单剂疫苗接种方案,但同一载体不应用于重复免疫。已经开发了表达狂犬病病毒糖蛋白的单复制周期黄病毒载体。它们在实验动物中表现出抗狂犬病病毒攻击的免疫原性和效力。这种疫苗平台尚未在临床试验中进行测试,因此无法预测其在成本效益方面的扩大潜力及其在人体中的表现。

痘病毒载体疫苗

几种类型的痘病毒已被导入并用作狂犬病疫苗(表5)。表达狂犬病病毒糖蛋白的痘苗病毒重组体被用于野生动物的免疫接种。尽管它们具有高度免疫原性,并且在单次给药后能可靠地诱导保护性免疫,但它们残留的毒性阻止了它们在人类中的应用。基于改良安卡拉痘苗(MVA)的载体减毒更多。这种病毒在细胞系中连续传代,导致约10%的基因组缺失,不再能够在灵长类细胞中复制。这种衰减降低了载体的免疫原性,在小鼠中,表达狂犬病病毒糖蛋白的MVA重组体仅实现了部分保护。其他痘病毒,如鸭痘病毒,已被导入表达狂犬病病毒糖蛋白。金丝雀疫苗在猫身上显示出了效力,并且现在被许可作为纯种猫狂犬病疫苗在一年和3年的免疫期内使用。与传统的组织培养衍生的狂犬病疫苗相比,该疫苗还在人类志愿者中进行了3次剂量的试验。该疫苗耐受性良好,能诱导狂犬病病毒中和抗体,但滴度迅速下降,远低于商业疫苗获得的滴度。重组副痘病毒在小鼠、犬和猫中诱导足够滴度的中和抗体,但其免疫原性仍低于痘苗病毒重组疫苗。

痘病毒载体虽然被许可用于野生动物免疫和猫的常规疫苗接种,但总体来说并不适合作为人类的单剂量疫苗——那些高免疫原性的疫苗反应原性太强,而那些减毒的疫苗缺乏免疫原性。

 腺病毒载体疫苗

腺病毒引起物种特异性感染。已经从各种物种中分离出多种血清型,并且一些来源于人类或猿猴血清型腺病毒已经作为针对过多病原体的预防性疫苗进行了临床试验。

通过将外源序列插入缺失的E3结构域,可以构建腺病毒载体以保持其复制能力,该结构域编码的多肽对病毒复制不是必需的,但可用于破坏免疫反应。基于表达狂犬病病毒糖蛋白的人类血清型5(hDv5)的复制能力腺病毒载体已经在北美获得了野生动物的免疫许可。由于其在人类宿主中的潜在毒力,野生型HAdV5病毒可导致肺炎、肠胃炎和/或肝炎,这些载体不适合用于人。

腺病毒通过在缺失的E1结构域插入序列而导致复制缺陷,该结构域编码对其他病毒基因转录至关重要的蛋白质。E1缺失的腺病毒载体诱导非常有效的T细胞和B细胞应答,由于病毒载体的低水平持久性,这种应答是异常持续的。如果以免疫原性剂量使用,它们在人体内耐受性良好。高剂量会诱发强烈的先天免疫反应,从而引发严重的副作用。狂犬病病毒腺病毒载体疫苗很可能具有成本效益,因为据估计,单剂疫苗的成本可能低至一美元。

腺病毒载体的主要缺点是它们的免疫原性和效力被针对载体的预先存在的中和抗体所削弱。腺病毒无处不在,大多数人在童年早期就被不同血清型感染。中和抗体的流行取决于病毒血清型和地理位置。在美国或欧洲,大约40%的成年人对研究得最好的血清型——人腺病毒5血清呈阳性,而在一些非洲国家,这一比率超过80%。在美国或欧洲,抗人腺病毒26型的抗体很少见,但在非洲很常见。表达狂犬病病毒糖蛋白的重组腺病毒的人类血清型,尽管它们在动物研究中已经产生了有希望的结果,因此不适合人类免疫。已经产生了基于从非人灵长类动物如黑猩猩分离的病毒的载体。这些病毒在系统发育上与人类血清型密切相关,不会在人类群体中传播。因此,大多数成年人缺乏针对猴腺病毒的中和抗体,而那些有抗体的人往往效价很低。一种表达狂犬病病毒糖蛋白的E1缺失型黑猩猩腺病毒SAdV-25(也称为AdC68)已经在小鼠和非人灵长类动物中进行了广泛的测试。在单次肌肉注射后,该病毒诱导有效和持续的病毒中和抗体反应,这很容易被狂犬病病毒增强。动物,包括非人灵长类动物,被证明是接种疫苗一年多后,完全免受攻击。这种疫苗计划用于临床试验,因此非常适合于PrEP。它将为目前的狂犬病疫苗提供一个成本有效的替代方案,并因此允许将狂犬病疫苗更广泛地纳入儿童免疫计划。作为有待测试的抗体反应可以通过使用两种异源黑猩猩腺病毒载体的初免增强方案来增加,这可以将疫苗的效力扩大到不属于进化群1的狂犬病病毒。

经过临床前测试的狂犬病疫苗数量令人印象深刻,但只有少数疫苗经过临床测试,其中大多数被证明相对无效。目前最有希望的方法是添加TLR-3佐剂的PIKA狂犬病疫苗,这种疫苗增加了许可疫苗的免疫原性,因此可以节省剂量。一种基于杆状病毒中产生的糖蛋白VLPs的蛋白质疫苗计划进行第三阶段临床试验,尽管早期临床试验的结果迄今尚未公布,但可以假定该疫苗在第一/第二阶段试验中显示出安全性和免疫原性,并且总体上不劣于目前的疫苗。减毒狂犬病病毒不太可能取代现有疫苗,但表达两个狂犬病病毒糖蛋白拷贝的基因修饰的灭活狂犬病疫苗可能对PrEP和PEP有用。假型病毒经历了有限的测试,在那里它们给出了有希望的结果,但是对人类毒性的担忧可能会阻碍它们向临床试验的过渡。上述四种类型的疫苗可用于PEP和PrEP,这不同于遗传疫苗,后者由于免疫原表达的延迟,仅应考虑用于PrEP。最有希望的核酸疫苗是E1缺失的SAdV-25载体,它对于在狂犬病高发地区纳入儿童免疫计划可能具有足够的成本效益。

致谢:

本章节:Novel Rabies Vaccines

作者:Hildegund C. J. Ertl

来源:本内容翻译自《Rabies and Rabies Vaccines》,翻译该章节完全出于个人兴趣,不用做其它。

原书:ISBN 978-3-030-21083-0 ISBN 978-3-030-21084-7 (eBook) https://doi.org/10.1007/978-3-030-21084-7

翻译:孟胜利

 

 




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